荧光显微镜的使用与显微摄影详细分析.ppt

光源 中间象 物镜 样品 聚光镜 目镜 电子枪 聚光镜 样品 物镜 中间象 投影镜 观察屏 照相底板 虚象 三、透射电镜的样品制作 （一）超薄切片法 主要步骤： 取材 固定 洗涤 脱水 浸透 包埋 聚合 修块 切片 装网 电子染色 上镜观察 1、取材 1mm3（或mm2） 活体取材，低温，4oC。 刀片锋利，动作轻巧迅速。 2、固定 电镜常用固定剂： 戊二醛、锇酸 固定方法： 戊二醛—锇酸双固定 前固定 2.5%戊二醛溶液，4oC，1—4小时。 洗涤 0.2M磷酸缓冲液，pH 7.4，5 — 6次，每次10分钟。 后固定 1%的锇酸溶液， 4oC，1小时。 洗涤 0.2M磷酸缓冲液，pH 7.4，3 —4次，每次10分钟。 c、注意事项 温度 在低温下进行，4oC。 时间 与固定液的浓度、种类有关。不可随意更改。 固定液的pH 接近组织的pH。 固定液的浓度 浓度过低，会发生组织肿胀、抽提； 浓度过高，组织收缩或遭破坏。 固定液的渗透压 应该接近组织液的渗透压。 3、脱水 一定浓度的酒精或丙酮系列 30% 50% 70% 80% 90% 95% 100%（2-3次），每步5—15分钟。 注意： a、70%脱水剂以上各步都在低温（4oC）下进行。 b、样品只有在70%脱水剂，4oC可以存放过夜。 c、脱水要彻底。 4、浸透 包埋剂成分： 树脂单体（环氧树脂618#、Epon812等）、固化剂、增塑剂及加速剂。 注意事项： 浸透要充分；包埋剂配制时要混匀各种成分；用具要干燥，防止包埋剂吸潮。 浸透过程： 无水丙酮 ?无水丙酮+1/2包埋剂（4小时） 纯包埋剂（过夜）。 5、包埋与聚合 包埋模包埋，加温聚合。 注意：防止产生气泡；包埋后要干燥，防止吸潮。 * * 七、荧光显微镜的使用 1、原理：用人眼不可见的一定波长的紫外光作光源照射被检物体，使之受激发后而产生人眼可见的荧光，然后再经显微镜成象系统放大来进行检测。 引起荧光最有效的光波区域为：0.32—0.40μｍ 2、荧光显微镜的装置 A、可以提供特定波长的光源装置，使被检物体得到理想的激发发出强的荧光。 B、可以吸收或反射短波光的一系列滤光片。 八、倒置显微镜 九、显微摄影 1、按不同类型显微镜的调节方式，对拍摄部位初步对焦。 2、视场光阑内切。 3、选择光路（包括显微镜的与取景器旁的） 4、安装胶卷 5、设置自动曝光装置 6、彩色照像要调色温，调电压或用滤光片 7、屈光度调节 8、按曝光按钮 9、取出胶卷 生物电子显微镜技术 第一节 透射电子显微镜技术 一、显微镜的分辨率与放大倍数 分辨率： d = 0.61λ / η·sinα 电子的波长： λ = h / mv h —普朗常数 , 6.62×10-27 尔格 / 秒 m —电子质量 , 9.1×10-28 克 v —电子运动速度 根据能量守恒定理： 1/2mv2 = eU e —电子电量 , 4.8×10-10 静电单位 U —电压 电子显微镜的电压50—100千伏。 电子波长为0.053—0.007?。 最佳孔径角为10-2—10-3弧度。 电镜的最高分辨率可达2—3?。 有效放大倍数可达100万倍。 12.25 λ = (?) U 入射电子 直接透射电子 小角度弹性碰撞电子 大角度弹性碰撞电子 小角度非弹性碰撞电子 背散射电子 俄歇电子 二次电子 阴极发光 X—射线 扫描电镜 透射电镜 1、 电子与样品作用后产生的信息 X—射线能谱分析 二、电子成像原理 样品 2、样品的成像 样品中质量密度小的区域，电子直接透射，形成亮区。 样品中质量密度大的区域，由于电子散射，形成暗区。 3、电磁透镜的放大作用 电子显微镜的透镜：电子的外加磁场。 磁透镜使电子会聚的原理 O O’ z 电子在磁透镜中的运动轨迹 A C 所有从O点出发的电子类似的轨迹运动，在v一定时，当轨迹与轴的角度很小时，电子会聚在O