分子生物学实验义2011-2012第1学期.doc

主编：邱 爱 东 2011-2012 第一学期 编者按： 分子生物学是一门动手性很强的实验科学，本科教学中的实验环节对学生从课堂理论到科研实践起到非常重要的衔接作用。为了更好的帮助学生理解分子生物学的基础理论，培养科研活动中的实际操作能力，并根据我校现有的实验基础条件，编者挑选出最具代表性的基础实验内容，编写了这本《分子生物学实验讲义》。 仅供我校生物工程、药学、制药工程等本科专业学生使用。 目 录 实验一 碱裂解法小量提取质粒DNA 实验二 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 实验三 质粒的酶切和鉴定 实验四 聚合酶链反应——PCR 实验一 碱裂解法小量提取质粒DNA 原理 细菌质粒（plasmid）是一些双链，闭环的DNA分子，其大小范围从1kb到200kb以上不等。是独立于细胞染色体之外能自主复制的遗传成份，多存在于原核生物细胞中，是目前基因克隆中最常用的载体分子。碱裂解法是最常用的提取质粒DNA的方法，可得到质粒DNA的粗提液；通过进一步纯化可得到较纯的质粒DNA。 从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解菌体；分离和纯化质粒DNA。离心收集菌体，用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，采用碱性SDS(十二烷基磺酸钠）溶液（溶液Ⅱ）裂解菌体细胞壁，使质粒缓慢释放出来。在碱性条件下，双链DNA变成单链，当PH调至中性并有高盐浓度存在下，绝大多数变性质粒恢复自然状态溶在液体中；而变性的细菌染色体DNA会相互交联缠绕附着在细胞碎片上，与蛋白质形成沉淀。离心获得含有大量质粒的上清液，再利用适当浓度的亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇、PEG8000）使质粒DNA脱水，离心得到质粒沉淀。 在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA(Open circularDNA，简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 二、材料、试剂及仪器 1. 材料： 　　 含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株。 试剂： 1）LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g， 酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中， 用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分 钟。 　　 2）LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 　　 3）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液， -20℃保存备用。 　　 4）溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml， 并分装成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。 　　 5）3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰 醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰 箱。 　　 6） 溶液Ⅰ50ml：50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L Tris·Cl（pH8.0）， 10mmol/L EDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15 分钟，储存于4℃冰箱。 　　 7）溶液Ⅱ100ml：0.2mol/LNaOH（临用前用2mol/L NaOH母液稀释）， 1%SDS（W/V，临用前用10%SDS母液稀释）。现用现配。 　　8）溶液Ⅲ 100ml：5mol/L 乙酸钾 60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml， 定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+ 3mol/L，Ac- 5mol/L。 　　 9）RNase母液：将RNA酶溶于10mmol/L Tris·Cl（pH7.5），15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟