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第七章  外源基因表达系统 基因工程所用的宿主菌,都是经过人工改造的. 原因是 野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统,会切割未经修饰的外源DNA. 经过改造的宿主菌一般具备下列特点 限制系统缺陷型:不切割外源DNA. 重组缺陷型 :避免外源DNA与宿主DNA的重组. 转化亲和型:改变细胞壁的通透性,提高转化效率. 二.大肠杆菌的表达条件 克隆的真核基因必须连续，无内含子序列。 大肠杆菌不能识别真核启动子，外源基因须置于原核启动子的控制之下。常用的启动子有 Lac 、trp、tac、T7、λPL等。 强启动子 外源蛋白质的表达占菌体总蛋 白质的10-30％。 启动子有关知识 大肠杆菌的启动子是控制外源基因转录的重要元件，基因表达程度与启动子的强弱密切相关。 启动子的强弱主要取决于 　　启动子本身的序列，尤其是－10区 TATAA 和－35区 TTGACA 的组成。 在真核基因中发现了类似Pribnow框的共同序列，即位于—25～—30 bp处的TATAAAAG，也称TATA框 TATAbox 。 常用的大肠杆菌启动子 Plac 　来源于乳糖操纵子 Ptrp　　来源于色氨酸操纵子 PL　　　来源于λ噬菌体早期操纵子 PrecA　　来源于recA基因 启动子的可控性 目前使用的大肠杆菌启动子，一般含有与阻遏蛋白特异性结合的序列，因此由这些启动子介导的外源基因在大肠杆菌细胞内通常是痕量表达的。例如在不含乳糖的培养基内， Plac 启动子处于阻遏状态，外源基因极少表达。 当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养物中加入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖苷 isopropylthiogalactoside，IPTG ,它们特异性的与阻遏蛋白结合，使之从操纵子上脱落下来，启动子打开并启动外源基因转录。（化学诱导） 温度诱导 PL启动子 将工程菌先置于300Ｃ进行培养，在此温度范围内，由大肠杆菌合成的CI 857阻遏蛋白与PL　的操纵子区域结合，关闭外源基因的转录。当工程菌培养到合适的生长阶段，（一般为对数生长中期）时，迅速将培养温度提高到42 0Ｃ，此时CI 857失活，从操纵子上脱落下来， PL启动子遂启动外源基因转录。 为解决此问题，可对工程菌进行改造。 　例如：采用双质粒表达系统　将CI 857阻遏蛋白编码基因置于Ptrp启动子之下，克隆在一个低表达质粒上，从而保证阻遏蛋白表达较低；第二个重组质粒则含有PL启动子控制的目的基因。当培养基中缺少色氨酸时， Ptrp打开， CI 857 阻遏蛋白生成，由PL介导的目的基因不表达；相反，当色氨酸大量存在时， Ptrp启动子关闭， CI 阻遏蛋白不再生成， PL开放。 此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组成的廉价培养基进行发酵，内含微量的色氨酸，欲使外源基因表达时，可加入富含色氨酸的胰蛋白胨进行诱导。 原核表达存在的问题 翻译后的加工修饰 真核细胞的某些蛋白质翻译合成后，还需要修饰，如糖基化，但大肠杆菌细胞无此功能。 细菌蛋白酶的存在 细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割 真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 1.表达产物存在的部位 ①细胞质；②细胞周质；③分泌到细胞外 ① 细胞质中表达： 包涵体（inclusion body :细胞质中不溶性的蛋白质聚集形成的颗粒。 优点： 形成包涵体，易于纯化分离，抵抗细菌蛋白酶的水解；对寄主无毒害 蛋白质产量高 表达载体构建比较简单 缺点： 形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性。恢复生物学活性的过程，有时非常困难。活性蛋白质的终产量低。 细胞质还原的环境不利于形成二硫键 N-末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响 蛋白质种类多，纯化工作量比较大。 ②周质中表达 周质（periplasm —大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构 表达于细胞质中的蛋白，借助信号肽穿过细胞内膜到达周质 优点： 蛋白种类少，易纯化 酶解程度低 促进二硫键的形成和蛋白质的折叠 蛋白质N-端真实性 缺点： 转运的效率不稳定 ③ 表达产物分泌到细胞外 诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质 利用信号肽； 融合蛋白配体； 透化剂； 优点： 酶解作用低 纯化方便 增进蛋白折叠 N-端的结构真实 短小芽孢杆菌表达蛋白质 例1：表达白细胞介素－2，表达产物无需复性处理，即具有生物活性。产率达50mg/L。 例2：表达人表皮生长因子（EGF），产率达1g/L以上。 澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊毛的技工，由于EGF可引起羊毛从根部自行脱落，故每只羊注射5mgEGF，在1月后可用手直接抓下羊毛。 利用梭菌属嗜热菌株由纤维素生产乙醇 纤维素是由葡萄糖单体以β－1，4－糖苷键连接的多糖，利用梭菌属嗜热菌株