高效液相色谱详细分析.pptVIP

第六讲 高效液相色谱技术HPLC（High Performance Liquid Chromatography） 6.1基本概念 1、高效液相色谱技术 一种典型的分配色谱，它是基于化合物在固定相和流动相之间分配系数的差异而实现分离的，由于经过了多次的吸附－解析－吸附的过程，其理论塔板数可高达数万（分析性HPLC） 2.反相液相色谱 反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求。 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性。 载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm ） Hypersil Spherosil XOB075 固定相：C18、C8等 流动相的选择：通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃 分析型色谱的目的是分离鉴别及定量测定， 制备型色谱的目的在于从复杂的混合物中分离得到一定量高纯度的化合物。在制备型高效液相色谱系统中使用较小颗粒（5-40μm）的固定相时，系统的复杂性及成本亦增大，但分辨率可得到较大的提高。 高效液相制备色谱相对于其他制备色谱，优势在于分离速度快、分离度高、所制备的化合物纯度高、上样量也能较大。 6.2高效液相制备色谱系统的建立6.2.1一般步骤 （1）色谱条件在分析型液相色谱柱上的优化 一般可先用分析型高效液相色谱来进行洗脱条件的选择，然后再将其转化为用于半制备型分离的洗脱条件。所使用的分析柱应装有与制备型色谱柱相同的填料，同时应使得容量因子尽可能小。 在寻找合适的分析型HPLC分离条件时，应使待测物与干扰杂质的分离度尽可能大，以适应在制备型HPLC分离过程中分离度下降导致所制备的化合物纯度下降。 （2）将色谱条件转换至制备型色谱系统 在找到适当的分析型色谱分离的条件后，应该将该条件转用于制备型液相色谱柱，所用的压力应为分析型分离时的1/3左右。不同类型色谱柱选择的流动相流速也要根据实际情况确定，根据实验结果判断分离效果。 （3）浓集 对所收集的洗脱液进行浓集。 （4）分析判断 利用薄层色谱或分析型高效液相色谱，对所得纯合物进行分析，判断纯度。 液相色谱仪（1） AKTA explorer 100色谱系统 6.2.2制备条件的选择 1、根据分离的目的，制备分离通常采用以下两种途径来实现。 （1）高效填料大直径柱，可在无超载的情况下，调整分离参数，完成分离。而小颗粒（10μm）柱常常用于高分离度产品的快速纯化，尽管大颗粒填料长柱同样能完成分离，但增加了分离时间。 （2）大颗粒（约50μm）填料大直径柱，在超载的状态下完成相对大量的制备和纯化，分离度大于1.2时，分离时间在柱超载时相对要缩短，在分离度损失不大的情况下，可采用较高的流速。 2、柱体积：制备型高效液相色谱分离的关键是色谱柱，所选择的色谱柱的大小取决于待分离样品的量。影响分离度的主要参数是选择性和容量因子，但色谱柱的其他一些参数对分离的成功也至关重要。 增加色谱柱的长度可以加大上样量和分离度；使用小颗粒的吸附剂和大直径的色谱柱有利于分离，但同时柱压也增加了。 3、填料：球形颗粒填料优于不规则颗粒的填料，它具有较高的机械强度，不易破碎。 大孔硅胶是最重要的液相色谱固定相，也被用于制备键合相固定相。对于制备型液相色谱通常采用直径在10-40μm或更大颗粒的填料。 未衍生的硅胶价格低廉但容易破坏样品，同时，其不可逆吸附的可能性较大，因此目前键合相填料的应用更为广泛。 4、流动相 一般尽量选择流动相或接近流动相组成的溶剂，以便减小洗脱体积并防止峰变形。 流速的选择：在柱长、上样量、梯度恒定的情况下，即可将经过优化的分析型分离条件直接转化至生产规模的分离，可用公式计算制备型系统中洗脱液的流速： 式中，X1为分析型系统中洗脱液的流速；X2为制备型系统中洗脱液的流速；r1为分析型色谱柱的半径；rp为制备型色谱柱的半径；CL为制备型色谱柱的长度与分析型色谱柱的长度之比。 根据公式，如果一分析型分离系统（柱直径为4.6mm）的洗脱流速为1ml/min,则具有相同的长度、直径为20mm的色谱柱需达到约19ml/min的洗脱液流速才能维持可比的线性流速。 选择流动相时应注意的几个问题： （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子，如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 5、样品量 柱子的载样量取决于柱体积、填料类型和分离的需要。不同的色谱模式