高效液相色谱原理详细分析.docVIP

高效液相色谱法（HPLC） 方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法 其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。 HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC） 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 （1）固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 （2）流动相（淋洗液） 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： 与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。 与所用的检测器相匹配。 应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。 具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。 应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。 液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。 4、高效液相色谱法的主要类型 （1）液—固吸附色谱法 ①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。 ②固定相：极性和非极性两种。 极性固定相：硅胶、氧化镁。 非极性固定相：多孔微粒活性炭、多孔石墨化炭黑。 ③流动相：基本原则：极性大的试样用极性较强的流动性；极性小的试样用极性较低的流动性。 液—固吸附色谱法适用于分离具有中等相对分子质量的非极性或非离子型的油样品；分离异构体；但不适用于分离同系物。 （2）液—液分配色谱法 ①分离原理：利用混合物中各组分在固定相和流动相中溶解度的差异来进行分离的。 ②正相与反相液-液分配色谱： 正相液—液色谱分离：流动相的极性小于固定液的极性。固定相为极性组分，流动相为非极性溶剂。适用于极性组分的分离。 反相液—液色谱分离：流动相的极性大于固定液的极性。固定相为非极性组分，流动相为极性溶剂。适用于非极性组分的分离。 ③固定相：固定液涂在载体上或微球吸附剂上。 ④流动相 （3）凝胶色谱法（分子排阻色谱法） 根据所用流动相的不同，凝胶色谱法可分为两类： 凝胶过滤色谱法：（GFC）用水溶剂作流动相。 凝胶渗透色谱法：（GPC）用有机溶剂四氢呋喃。 凝胶色谱法主要用来分析高分子物质的分子量分布，以鉴定高分子聚合机理，选择聚合工艺及条件，并考察聚合材料在加工和使用过程中分子量的变化。 二、高效液相色谱仪 1、仪器基本构造 先做一个个单元组件，然后根据需要将各个单元组件组合起来。 最基本的组件是高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器和工作站（数据处理系统）。 可根据需要配置自动进样系统、预柱、流动相在线脱气装置和自动控制系统等。 下图是典型HPLC系统的结构示意图 仪器工作流程： 高压输液泵将储液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至工作站记录、处理和保存。 流动相净化装置 过滤： 原因是防止不溶物堵塞流路或色谱柱。 方法是用0.45μL以下微孔滤膜（有机溶剂或水）过滤。 脱气： 原因是溶解有氧气或混入了空气而形成气泡，会使色谱图上出现尖锐的噪声峰；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，致使基线起伏。 方法有超声波震荡脱气、惰性气体鼓泡吹扫脱气、在线（真空）脱气。目前广泛使用的是超声波震荡脱气。其方法是将配好的流动相连同容器一起放入超声波水槽中脱气10~20min。 高压输液系统 高压输液系统一般包括贮液器、高压输液泵、梯度洗脱装置等。 储液器：由玻璃、不锈钢或特种塑料制成。 高压输液泵：是高效液相色谱仪的关键部件。 其作用是将流动相以稳定的流速或压力送到色谱分离系统。 要求是压