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细菌标本形态学检验 　 一、不染色标本检查法 不染色标本的检查用于观察活菌状态，常用以检查细菌的动力或运动状况。 1．湿片法：用接种环取细菌培养液两环， 置于载玻片中央，轻轻覆以盖玻片。菌液要适量，不可外溢，不可有气泡。高倍镜下观察。 2．悬滴法：加一小滴菌液在盖玻片中央，在另一凹玻片凹窝的周围涂少量凡士林，将凹面向下，对准盖玻片中央，盖在凹玻片上，迅速翻转玻片，用小镊子轻压，使盖玻片与凹玻片粘紧，密封凹窝边缘。高倍镜下观察。 3．毛细管法：本法适用于观察厌氧菌动力。先将待检菌接种在适宜的液体培养基中，经厌氧过夜培养后，以毛细管（长60～70nm ，管径0．5 ～1．0nm ） 接触培养物，使菌液进入毛细管中，用火焰封闭毛细管两端，将毛细管固定在载玻片上，镜检。 二、染色标本检查法 （一） 基本方法 细菌胞浆无色透明，不易识别。常用适宜的染料使细菌着色后，以观察其形态和特殊构造，且可按染色反应进行分类。 1．原理 （1） 物理吸附作用：由于毛细管现象和渗透作用， 使染料进入细胞内被溶解吸收。此外，细菌等电点较低，pH值2 ～5，在一般情况下细菌带负电荷，易和带正电荷的碱性染料相结合。 （2） 化学反应：菌体内某些化合物和染料相结合，发生化学反应使细菌着色，而且不易被脱色剂所脱色。 （3） 其他因素：细胞膜的通透性、膜孔的大小、细胞结构完整与否以及培养基成分，染色液中电解质含量、pH值、菌龄等都是影响细菌着色的因素。 2．方法 （1） 涂片：临床标本大多可直接涂抹在洁净的载玻片上。若是细菌的液体培养物，可直接加一小滴在载玻片，稍加涂布。若是从固体培养基上取细菌菌落，则应先用接种环取一环生理盐水置于玻片上，然后从培养基上取少许菌在盐水中轻轻磨匀，使呈轻微乳白浑浊，再涂布扩大至直径20 mm 大小的圆形，待自然干燥，也可加微热使其干燥。 （2） 固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通过3 次加以固定。固定过程可杀死细菌，凝固细胞质和其他细胞结构，增加细菌细胞对染液的通透性，还可使细菌涂膜牢固，不被在染色过程中的流水冲洗脱落。 （3） 染色：一般用低浓度染色液（1％以下），滴加染液覆盖涂膜。分单染法和复染法。为促使染料与菌体结合，有的染色法可在染液中加入酚、明矾，有的在染色过程中加碘液，可起到媒染的作用，也有用加热法促进着色的。 （4） 脱色：一般应用乙醇、丙酮或酸类作为脱色剂。适当掌握脱色时间以获良好的效果。脱色剂可以显示出细菌与染料结合的牢固程度，具有鉴别染色的作用。 （5） 复染：复染液应与初染液的颜色不同，以形成鲜明对比。复染可使已脱色的细菌重新着色。 （二） 常用染色法 1．单染法 即用一种染液染色的方法。 （1） 染液①吕氏亚甲蓝液：以亚甲蓝乙醇饱和溶液（乙醇100 ml 含亚甲蓝2～5g）30 ml 加蒸馏水100 ml 及10％氢氧化钾0．1 ml 混合即成。②稀释石炭酸复红液：以碱性复 红乙醇饱和液（乙醇100 ml 含碱性复红3～7g）10 ml 与5％石炭酸液90 ml 混合， 配成石炭酸复红染液。再将此染液以蒸馏水作10 倍稀释即成。 （2） 方法：在已固定的细菌涂片上滴加吕氏美蓝液或稀释石炭酸复红，染1 分钟，水洗，干后镜检。 （3） 结果：以吕氏亚甲蓝染色， 菌体呈蓝色。以稀释石炭酸复红染色，菌体呈红色。 2．革兰染色法 为最常用的细菌复染法。 （1） 染液：第一液：取结晶紫乙醇饱和液（乙醇100 ml 含结晶紫7 ～14g）20 ml 与1 ％草酸铵水溶液80 ml 混合过滤即成。第二液：碘1g ，碘化钾2g ，加少量蒸馏水，充分振摇，溶解后加水至300 ml 。第三液：95 ％ 乙醇或用乙醇、丙酮（7 ∶3） 混合液。第四液：稀释石炭酸复红液（同单染法） 或沙黄溶液（2．5 ％沙黄乙醇液10 ml 加水90 ml）。 （2） 方法：将第一液滴加在已固定的细菌涂片上，染1 分钟，水洗。再以第二液媒染1 分钟，水洗。继以第三液脱色。轻摇玻片，到无紫色脱落为止，水洗。最后以第四液复染0．5 分钟，水洗，干后镜检。 （3） 结果：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。 3．抗酸染色法 （1） 染液：①石炭酸复红染液：同单染法，但不需用蒸馏水稀释。②脱色剂：为盐酸乙醇。③复染液（吕氏亚甲蓝液） 同单染法。 （2） 方法：在涂片上滴加石炭酸复红染液，玻片远离火焰使微微加热而有蒸汽，染液因蒸发而减少，需随时补加染液，防止干涸。如此维持5 分钟。待冷后，水洗。滴加脱色剂，轻摇玻片，到无红色流出为止，脱色时间约1 分钟。水洗。再滴加复染液复染0．5 分钟，水洗。干后镜检。 （3） 结果：抗酸菌呈红色，背景及其他细菌呈蓝色。 4．金胺染色法 （1） 染液：① 金胺“O ” 染液： 金胺“O ”0．1g 溶于95 ％ 乙醇10