熏烟和气道内滴入脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型.docVIP

熏烟和气道内滴入脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型 　　摘要：目的 评价熏烟和气道内滴入脂多糖（LPS）建立大鼠慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型的可行性。方法 40只SD大鼠随机分为正常对照组和COPD模型组，模型组熏烟和气道内滴入LPS16w。测定气道阻力，计数大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数，肺组织病理切片行HE和AB-PAS染色，并测定肺组织粘蛋白（MUC5AC）含量。结果 模型组大鼠气道阻力增加（RL%）较对照组有显著性差异，BALF中白细胞总数明显高于对照组，光镜下可见病变呈慢性支气管炎，肺组织MUC5AC含量明显高于对照组。结论 熏烟和气道内滴入LPS能建立较符合人类COPD病变的大鼠模型，为进一步的研究提供参照资料。 　　关键词：肺疾病；慢性阻塞；脂多糖；吸烟；大鼠 　　慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常见的呼吸道疾病，目前发病率和病死率都较高，社会经济负担重，但其发病机制尚不明确，影响了该病药物的研发。鉴于吸烟和反复不断的气道感染是COPD发生发展的主要原因，我们采用熏烟和气道内滴入LPS的方法建立COPD的大鼠模型，为进一步研究人类COPD提供参照资料。 　　1资料与方法 　　1.1试剂与动物 脂多糖（LPS，EsherichiacoliO111：B4，美国Sigma公司）；乙酰甲胆碱（Mch，美国Sigma公司）；MUC5AC（粘蛋白）ELISA试剂盒（武汉优尔生科技有限公司）。健康雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由浙江省实验动物中心提供。 　　1.2造模方法 SD大鼠40只，随机分为正常对照组和COPD模型组。将模型组大鼠分批置于自制有机玻璃密闭熏烟箱（85 cm×85 cm×45 cm）内，每天（一周6d，滴LPS当天除外）共烟熏40 min，分2次进行，1次给予12支Marlboro香烟，持续20min，间隔10min再熏烟1次，每批总共给予24支香烟。气道内滴入LPS的时间为每隔2w 1次，除对照组外，其余大鼠气管内用静脉套管针滴入200μg脂多糖（用生理盐水配制成1 g·L-1溶液），对照组气道内滴入等量生理盐水（NS），每隔2w 1次至第16w结束。 　　1.3大鼠气道阻力（RL）测定[1] 第16w后用30%乌拉坦（3.3 ml·kg-1，ip）麻醉大鼠，用Medlab生物信号采集处理系统记录仪，导出基础潮气量（VT）和气道流速（V），计算RL。配制浓度为0.125、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg·mL-1的Mch，分别置于雾化吸入机中，测出不同浓度Mch诱导下的大鼠潮气量和气道流速，通过RL的变化得出气道阻力的增加值（RL%）。 　　1.4支气管肺泡灌 洗液白细胞计数：股动脉放血处死大鼠，用8 ml生理盐水进行支气管肺泡灌洗，灌洗分2次进行。回收支气管肺泡灌洗液（BALF）。BALF 4℃，1000 r·min-1离心10 min，取上清液-80 ℃保存，沉淀用NS 0.5 mL混匀，取细胞混悬液100 μL用白细胞计数液100 μL稀释，计数BALF中白细胞总数。 　　1.5病理学检查 病理组织切片，常规HE染色观察炎症细胞浸润，阿尔辛蓝-过碘酸雪夫染色（AB-PAS）观察气道杯状细胞及黏液分泌，测定如下指标。 　　1.5.1肺组织炎症程度 HE染色切片中，根据炎症及上皮脱落程度将炎症分为+，++，+++三个等级。+为未见明显炎症细胞浸润；++为少量炎症细胞浸润；+++为可见大量炎症细胞浸润，并可出现管壁破坏及（或）上皮脱落。 　　1.5.2杯状细胞比值 每张AB-PAS染色切片中，计算1支支气管和3～5支细支气管阳性杯状细胞数和柱状上皮细胞的总数，得出阳性杯状细胞数/柱状上皮细胞总数的比值，即杯状细胞阳性百分率，求平均值。 　　1.6肺组织MUC5AC含量测定 用酶联免疫吸附法（ELISA）测定。 　　1.7统计学方法 采用SPSS 16.0 for windows进行统计学分析，计量资料以x±s表示，采用两组间均数t检验，等级资料采用RADIT分析，P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1两组大鼠气道阻力（RL） 在Mch 0.5，1.0，2.0，8.0，16.0 mg·mL-1浓度刺激下，模型组气道阻力增加（RL%）较对照组有显著性差异（P0.05）。见图1。 　　2.2 BALF中白细胞总数 模型组BALF中白细胞总数为（105.15±41.59）×107/L，对照组为（36.75±12.83）×107/L，可见模型组较对照组明显增多（P0.001）。 　　2.3两组大鼠肺组织炎症 光镜下对照组肺组织无炎症细胞浸