中南民族大学研生酶学第三章酶活性的测定及分离纯化.docVIP

第三章 酶活性的测定及分离纯化 在酶的分离纯化、性质研究以及酶制剂的生产和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。 3.1 酶活性单位 酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与酶蛋白的浓度有关，又与酶分子的催化能力大小有关。酶活性用单位体积或单位质量酶制剂所含的酶单位来表示，即u/ml或u/mg。 3.1.1 实用单位 不同的酶采用不同的标准。如DNA聚合酶Ⅰ以在特定反应条件下，30分钟内催化10nmol dNTP合成为TCA（三氯乙酸）不溶物所需的酶量；又如T4 DNA连接酶的单位定义为：在20μl反应体积中，16℃，30分钟内，将50%的HindⅢ酶切的λDNA片段重新连接起来所需的酶量。ACC合成酶 乙酰辅酶A羧化酶合成酶在标准条件下，每摩尔单体酶或每摩尔催化中心在1分钟内转换底物成产物的μmol数，可表示为： 1/Kp称为一个催化循环，单位为分钟。 3.1.5 比活性 酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位为u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶的纯度越高。 但在实际工作中，人们为了工作方便，往往对不同的酶使用不同的酶活单位。 3.2 酶活性测定的主要方法 酶活性的测定应在最适酶反应条件下进行（温度、pH、离子强度、反应时间等），可测定反应物的减少量或产物的生成量。随着反应的进行，底物减少，产物积累，会使得反应速度变慢。因此，必须测定反应的初速度。通常以底物浓度的变化在起始浓度的5%以内的速度为初速度的近似值。酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，而酶反应速度又与酶浓度密切相关。 3.2.1 分光光度法（spectrophotometry） 硝酸还原酶将NO3－ 还原成NO2－，NO2－与加入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应生成玫瑰红色的偶氮化合物，在520nm处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以NAD+或NADP+为辅酶，NAD+或NADP+在340nm处光吸收很少，而其还原形式NADH和NADPH在340nm处光吸收较大，因此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。 对于一些底物或产物没有光吸收变化的酶反应，可以偶联一个适当的酶，以原初反应的产物作为偶联酶的底物，而偶联酶的产物可用分光光度法测定。 3.2.2 旋光测定法（polarimetry） 若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶活性。 3.2.3 荧光法（fluorescence） 氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧光，还原态失去荧光。NAD+和NADP+无荧光，而NADH和NADPH有460nm蓝色荧光。荧光法灵敏度高。 3.2.4 同位素测定法（isotope determination） 用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体，就易于分离。 3.2.5 电化学方法（electrochemistry） 3.2.5.1 pH测定 对于某些酶促反应过程中会产生H＋或减少H＋的反应来说，用pH单位的pH计测定反应液的pH变化，或为保持pH不变而加入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 3.2.5.2 电位测定 在一些酶促氧化还原反应中，底物和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微电流极化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化 3.2.5.3 电流测定 原理同上，以恒定电压的两个铂电极测电流变化。 3.2.6 化学反应法（chemical reaction） 酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，用化学方法分析底物或产物的量。如ACC的测定：加HgCl2终止反应，加NaOCl－NaOH混合液使ACC转化成乙烯，再用气相色谱测乙烯。 3.3 酶的分离纯化 3.3.1 酶分离纯化的一般原则 酶的分离纯化是酶学研究的基础，对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。因为酶是蛋白质，所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。但酶又有特殊性，利用它们的特殊性还可以设计出特殊的纯化方法。为了进行酶学研究，必须获得适量的酶。首先要选择适当的材料，破碎细胞（酶存在于细胞外则不必破碎细胞）。若酶主要存在于某一细胞器中，应尽量分离出该细胞器。纯化酶的过程中要注意保护酶的活性，每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度，算出比活性、收率及纯化倍数。若某一步骤的收率或纯化倍数太低，说明该步骤不合适。酶纯化一般在低温条件