菌体细胞裂解法汇总.docVIP

菌体 细胞裂解法汇总一、反复冻融法：1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。/c?word %B4%F3%B3%A6%3B%B8%CB%BE%FA%2C%C1%D1%BD%E2url http%3A//www%2Ebioon%2Ecom/experiment/mb/mb1/200410/80878%2Ehtmlb 0a 3user baidu2、至少3次以上冻溶。/bbs/actions/archie/post/座机电话号码_0.html3、IFCC推荐法：收集细胞悬液，4低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。/bbs/actions/archie/post/252157_0.html4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻/dispbbs.asp?BoardID 89ID 142945replyID 597858skin 1二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。/bbs/actions/archie/post/座机电话号码_0.html2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。/bbs/actions/archie/post/座机电话号码_0.html3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。/bbs/actions/archie/post/1861187_0.html4、综合冻融和超声的方法：1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。可选择：4下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol三、渗透法：冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。《精编分子生物学实验指南》四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。/bbs/actions/archie/post/1166442_0.html2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。/bbs/post/iew?bid 65id 座机电话号码sty 3keywords SDS+%C1%D1%BD%E23、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。/bbs/actions/archie/post/座机电话号码_0.html4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA PH8.0 ，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl PH6.8 ，14.96 ml 蒸馏水。/bbs/actions/archie/post/196557_1.html5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不就可以了吗？/bbs/actions/archie/post/座机电话号码_0.html6、将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2×上样缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。/bbs/post/iew?bid 65id 座机电话号码sty 3age 0tpg 1ppg 1#座机电话号码7、检测蛋白诱导：从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100加热3min，然后12000g×