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菌种生产操作工艺规范 试管母种制作、扩繁及培养： 1．配方 (1)PDA培养基: 土豆(去皮)200g 葡萄糖20g 琼脂18-20g 水1000ml PH值自然。 (2)综合培养基: 土豆(去皮)200g 葡萄糖20g 琼脂18-20g 磷酸二氢钾3g 硫酸镁1.5g 维生素B110mg 水1000ml PH值自然。 (3)树汁培养基: 树汁培养基40g 啤酒100ml 温水1000ml PH值自然。 2．培养基配制 ·PDA培养基 (1)选择质量好的土豆,洗净后去皮,切成2mm薄片,并根据配方准确称量,加入1000ml水煮沸30分钟（无白心）,用4-6层纱布过滤,取其汁液,并加水补至1000ml。 (2)将琼脂加入土豆汁中,以小火加热至全部溶化，在加热过程中要不断搅拌,以防溢出和焦底。 (3)加入葡萄糖和其它营养物质使其溶化,调节PH值为自然。 ·树汁培养基 将树汁培养基放入锅中,加啤酒活化搅拌,泡沫消失后,加入温水搅拌加热煮沸,趁热分装试管。 3．分装试管 (1)制备好的培养基应趁热分装,装量为试管长度的1/4-1/5,试管口沾附的培养基要擦净。 (2)分装完毕,塞上棉塞,7支一捆,用两层报纸或一层牛皮纸捆扎好，直立放入灭菌锅桶内。 (3)棉塞松紧适度,以用手提起棉塞而试管不脱落为度,棉塞长度3-5cm,塞入试管中的长度约占总长的2/3。 (4)棉塞制作宜选用质量好的普通棉花,不宜使用脱脂棉或夹杂晴纶棉等杂质。 4．灭菌 (1)向灭菌锅内加水至水位标记高度,不能过多或过少,过少易烧干造成事故,过多棉塞易受潮;引起杂菌污染。 (2)对称拧紧锅盖上螺丝,勿使漏气,打开放气阀,加热灭菌。 (3)当有大量蒸汽从放气阀中快速排出时,关闭放气阀,继续加热。 (4)当压力达到1.0kg/cm2时,开始计时,并调节火力大小,维持45分钟后,停止加热,自然缓慢降压。 (5)待压力下降到零时打开放气阀,缓慢排出残留蒸汽,打开锅盖,稍留一缝盖好保持10-15分钟,利用余热烘干棉塞。 (6)趁热摆斜面,并覆盖棉布,以防冷凝水凝结。 (7)灭菌锅补足水量,以备继续使用。 5．转管、扩繁 (1)将待转保存菌株从冰箱领出,经24小时活化后使用。 (2)将经过活化的菌株及空白斜面培养基及酒精灯、接种铲、接种钩、75%酒精棉球、火柴等用具整齐放入接种箱内,根据接种箱体积计算用药量,密闭熏蒸消毒45分钟。 (3)接种时,戴乳胶手套,进入接种箱后用75%酒精双手彻底消毒,待双手酒精挥发后,点燃酒精灯,对接种铲、接种钩过火杀菌,冷却备用。 （4）转接时，母种试管口过火杀菌,然后用冷却后的接种铲、接种钩划线,切断菌丝。转接时，用左手平行并排拿起母种试管和待接种试管,斜面均向上,管口要齐平,在火焰上方用右手无名指及小指拔下棉塞,随后用接种铲将菌种块(3mm见方)迅速移入新的斜面试管中部,再在烤一下试管口,塞上过火焰的棉塞。 (5)接完种的试管,逐支贴上标签,注明菌株名称及接种日期等,做好记录,并清理接种箱。 (6)整个接种过程要严格无菌操作,试管口不得离开火焰形成的无菌区,棉塞不得接触未经灭菌的物品。 (7)母种接种块周围以及斜面前端约1cm薄的部分去掉,尽量挑选菌龄短的健壮菌丝块进行接种。 6．母种培养及保存 (1)母种避光25℃左右恒温培养,空气相对温度保持在60%左右。 (2)2-3天后检查菌丝的生长及杂菌污染情况,发现污染立即淘汰。 (3)以后每隔一天检查一次并做好记录。 (4)菌丝满管后及时用于生产或置冰箱中4℃保藏备用。 7．优质母种标准 (1)菌种纯正,无杂菌污染。 (2)菌丝洁白浓密。气生菌丝多。 (3)菌丝不老化变色。 （4）一般室温保存不超过15天,4℃冷藏不超过3个月。 二．麦粒原种制作 1、配方:小麦粒98% 石膏2% PH值6.5-7.0 2、麦粒预处理 （1）选用无病虫害的小麦粒(最好为一年以上陈麦粒),用3%石灰水浸泡,水温20℃以上浸泡14小时,15℃以下浸泡20小时,30℃以上浸泡12小时。过夜应换水。浸至麦粒饱和,色转红棕为度,然后捞出清水清洗,沥去多余水分。 （2）投入沸水中煮20分钟左右,使麦粒充分煮透,胀而不破,掰开后无白心即可。 （3）冷却后沥水摊开,晾干表面水分。 （4）加2%石膏混合均匀,然后装袋(瓶)。 3、分装封口: 用15×33聚丙烯菌种袋或菌种瓶,装量200g左右, 铺平料面, 弹净袋口及袋外壁沾附的培养基,套入套环,用无棉盖体或棉花封口,无棉盖体要扣紧,棉塞要松紧适度,有微孔及时胶带粘贴。 4、灭菌:将装好的原种整齐码入灭菌筐并及时入锅灭菌。灭菌1.5kg/cm2保持2小时,灭菌后及时出锅并运入接种区冷却。整个装、出锅过程注意轻拿轻