第五章酶分子修饰详细分析.ppt

* 水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可使酶的空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。 * 水溶性大分子与酶结合后，可在酶的外围形成保护层，使酶的空间结构免受其它因素影响，从而增加酶的稳定性，延长其半衰期。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2．羧基修饰 常用的羧基修饰剂有：碳二亚胺、乙醇—盐酸试剂、异恶唑盐等。其中水溶性的碳二亚胺类特定的修饰酶的羧基已成为最普遍的标准方法，它在比较温和的条件下就可以进行。 3．胍基修饰 蛋白质分子中精氨酸残基的侧链是胍基。采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环改变酶分子的性质和结构的方法称为胍基修饰。胍基修饰剂有：环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。 巯基在维持亚基间的相互作用和酶催化过程中起重要作用，巯基具有很强的亲核性，在含有半胱氨酸的酶分子中是最容易反应的侧链基团。已经开发了许多修饰巯基的特异性修饰剂。其中Ellman 试剂[DTNB, 5’5’-二硫代-双（2-硝基）苯甲酸]是最常用的巯基修饰剂，可以对酶分子中巯基的数目进行定量，用于研究巯基改变程度和巯基所处的环境以及蛋白质的构象变化。 4．巯基修饰 [DTNB, 5’5’-二硫代-双（2-硝基）苯甲酸] DTNB与巯基反应形成二硫键，释放出1个2-硝基-5-硫代苯甲酸阴离子，此阴离子在412nm处有最大吸收，因此能够通过光吸收的变化跟踪反应程度。 5．酚基修饰 修饰酶蛋白酪氨酸残基的酚环。有硝化法，琥珀酰化法、碘化法等。 四硝基甲烷（TNM） 琥珀酸酐 焦碳酸二乙酯（DPC） + CH3CH2OH + CO2 碘代乙酸 组氨酸残基位于许多酶的活性中心，常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPC）和碘代乙酸。DPC在近中性的PH下对组氨酸残基有较好的专一性，产物在240nm处有最大吸收，可跟踪反应和定量。 6．咪唑基修饰 双功能试剂分子两端功能基团的反应活性，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其它分子之间发生交联反应。 近年来，设计了一些对称的“双头”试剂，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间搭桥，形成多肽链内的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变，这种试剂称为双功能试剂。如戊二醛、乙二胺、二氨基丁烷等。 7．分子内交联修饰 第五节 酶蛋白主链修饰 肽链有限水解修饰 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 通过主链修饰，可以知道酶活性中心在主链上的位置，了解主链不同位置对酶催化功能的贡献。 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。 胃蛋白酶原的激活 1．主链的切断修饰 主链切断后，可能出现下列3种情况： ①主链切断后，酶活性中心遭到破坏、酶失活。这种修饰主要用于探测酶活性中心的位置。 ②主链切断后，仍可保持酶活性中心的构象，酶的催化功能可以保持不变或损失不多，同时酶的抗原性降低或消失。 有些酶蛋白具有抗原性。酶的抗原性与其分子大小有关，大分子的外源蛋白往往有较强的抗原性，而小分子蛋白或肽段的抗原性较低或无抗原性。 采用适当的方法使酶分子肽链在特定的位点切断，其相对分子量减小，就有可能在基本保持酶活力的同时，使酶的抗原性降低或消失，这种修饰方法又称为“肽链的有限水解修饰”。 例如：木瓜蛋白酶，用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，切除其肽链的三分之二，该酶的活力基本保持，其抗原性却大大降低； 酵母的烯醇化酶有限水解，切除150个氨基酸残基的肽段后，酶活力仍然保持，抗原性却显著降低。 ③若主链的断裂有利于酶活性中心的形成，则在切断修饰之后，酶蛋白显示其催化功能或酶活力的提高。 例如，胰蛋白酶酶原，用肠激酶或胰蛋白酶进行修饰，切除一个六肽，从而显示胰蛋白酶的催化功能。 天冬氨酸酶经过胰蛋白酶修饰，从C末端切除10多个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5.5倍。 这说明天然酶并不总是处于最佳构象状态。 胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 2．主链连接修饰——“多酶融合体” 主链连接修饰是通过基因融合技术，将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成的融合基因，再经过克隆和表达，获得各种多酶融合体。 所谓多酶融合体是具有两种或两种以上催化活性的酶连接在一条肽链上，往往是基因融合的产物。它可以是单体酶，也可以是寡聚酶。 例如：天冬氨酶激酶——高丝氨酸脱氢酶融合体是α4四聚体（Mr 4×86 KD）。 每条肽链含有两个活性区域：N-端部分的天冬氨酸激酶和C-端部分的高丝氨酸脱氢酶。这两个活性区域用蛋白酶水解切开后，分别具有两种酶的催化活性，这种一条肽链连接两种不同酶活性的酶称为“双头酶”。 3．主链剪接修饰 迄今，主链剪接修