病毒的纯化与保存技术方案.pptVIP

病毒的纯化和保存 病毒纯化目的(了解) 为了了解病毒的结构、传染与免疫、遗传与变异等性质，常常需要高纯度的病毒 病毒纯化原理(熟悉) 利用物理或化学的方法尽可能地去除宿主细胞中的组分，将病毒从其宿主细胞内提纯出来，在纯化过程中保持病毒的生物活性和感染性。 病毒纯化的一般原则(熟悉) 1、释放病毒到胞外 1.1 容易释放病毒(培养液/尿囊液) 1.2 不容易释放病毒(细胞破碎) 2、去除细胞碎块 低速离心，以2000～6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质 3、病毒悬液浓缩 细胞破碎方法(熟悉) 超声破碎：密集的小气泡迅速炸裂，破坏细胞 高压匀浆：机械切割力 高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂 酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶 化学渗透：渗透压改变使细胞破裂 反复冻融：形成冰晶，使细胞膨胀破裂 病毒纯化方法聚乙二醇(PEG)浓缩法 PEG是环氧乙烷和水缩合而成的水溶性非离子聚合物，无毒、无刺激性。 平均分子量不同，性质也有差异。分子量200～600者常温下是无色无臭粘稠液体，分子量在600以上者就逐渐变为半固体状、蜡状固体。 随着分子量的增大，其吸湿能力相应降低。 不同分子量PEG性质比较 聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握) 分子量2000～6000的PEG用于病毒浓缩 ?PEG可使病毒颗粒形成多聚体，较低离心力即可沉淀 (1)直接加入法 病毒悬液量少时候使用此法； 病毒悬液中加入8%-10%的PEG 聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握) (2)液体浓缩法 聚乙二醇(PEG)浓缩法(掌握) (3)固体浓缩法 将PEG固体覆盖于装有病毒悬液的透析袋上，进行浓缩。 透析袋孔径大小 超过滤法(熟悉) 原理：利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将大分子或病毒等颗粒截留。 超滤膜孔径要比病毒颗粒小 只能去除比病毒小的细胞碎块 吸附法(熟悉) 原理：病毒颗粒表面离子与吸附剂有亲和性，病毒吸附之后，使用适当的条件将病毒洗脱下来。 吸附剂必须具备的特点： 较大的表面积和吸附能力； 较高的吸附选择性； 便于洗脱； 性质稳定； 凝胶吸附法-磷酸钙凝胶 常用的凝胶，由0.5 mol/L CaCl2和0.5 mol/L Na2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物，用0.001 mol/L磷酸盐缓冲液悬浮，置于4℃4～5天，使之充分沉淀后应用。 凝胶吸附法-氢氧化锌凝胶 是由7 mol/L氨水与0.1 mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH8.5)制备，在制备后数小时内较稳定。 方法：将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使它们形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5)解离回收病毒。　 凝胶吸附法-焦磷酸镁凝胶 是由0.1 mol/L焦磷酸钠和0.1 mol/L MgCl2，以2：10(体积)比例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶。 将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于凝胶，然后用0.1 mol/L盐水洗2次，最后用0.3 mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒较好地回收于水相中。 红细胞吸附法(熟悉) 用于某些与红细胞吸附的病毒的浓缩 选择适宜的动物红细胞：鸡红细胞 基本步骤：1) 1%-3%的红细胞与病毒悬液混合，2吸附1h以上； 2) 1000 r/min 离心10分钟，沉淀吸附病毒的红细胞，弃上清，生理盐水洗涤2次； 3) 用1/50原体积的磷酸缓冲液重悬红细胞沉淀，在37保温2-3h； 4) 1000 r/min 离心10分钟，上清即是浓缩的病毒悬液。 葡聚糖柱层析法(熟悉) 葡聚糖凝胶是指由葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。 最常见的是Sephadex 系列，主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。 葡聚糖柱层析法(熟悉) Sephadex 的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex 的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。 G-25 分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离； G-200 分离范围 5000-600000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。 葡聚糖柱层析法 将初步浓缩的材料，通过葡聚糖G150或G200柱层析，然后用0.02～0.15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)洗脱，分部收集，测定280nm波长处的OD值，滴定各部分的效价，将含病毒的各部分相混合，再浓缩，透析之后，即