健康食品辅助调整过敏体质功能评估方法修订草案.doc

健康食品輔助調整過敏體質功能評估方法修草案 壹、前言 健康食品的「輔助調整過敏體質」功能評估，是減少過敏免疫反應之功能評估。所謂降低過敏免疫反應，針對不同過敏型式有各種過敏反應的指標，例如：降低血清過敏抗體含量、降低發炎反應、減少過敏反應相關細胞激素或介質的分泌、調節T 細胞分泌細胞激素、降低呼吸阻力等。但必須在不影響正常免疫反應的情況下，對過敏指標有減輕作用，對健康才有助益。動物實驗可以利用過敏原致敏動物，再進行過敏抗原特異性免疫反應的評估。 貳、實驗方法 一、動物實驗 實驗動物：建議選用小鼠，常用的BALB/c 或是C57BL/6 小鼠皆可，6-8 週大，雄鼠或雌鼠皆可，每組為單一性別隻數至少10 隻。組別包括未致敏的對照組、致敏未補充樣品的控制組、以及致敏且餵食樣品不同劑量的處理組等。實驗報告須附上原始數據，並包括圖表呈現實驗期間動物的攝食量、生長曲線、體重、以及各重要器官的組織重等，相關實驗動物必備之基礎數據。 （一）致敏小鼠 本動物實驗之過敏免疫反應是以腹腔注射過敏原的模式進行，採用過敏原作為抗原，加入佐劑(adjuvant) (例如氫氧化鋁)。在注射抗原前及注射抗原適當時間 (或週) 後以眼窩採血，取得血清進行抗原特異性抗體濃度之分析，確立動物過敏模式之建立，必要時須致敏至次。對於呼吸道過敏之動物模式，宜另以噴霧致敏法使從呼吸道接觸過敏原，鼻腔過敏之動物模式宜以鼻腔接觸過敏原等各種不同過敏動物式(1)。 血液抗體濃度 可利用sandwich-ELISA 免疫呈色反應法或Radial immunodiffusion (RID)法，定量血清中免疫球蛋白IgE、IgG、IgM、IgA 和總抗體含量利用免疫呈色反應法測定免疫球蛋白濃度：將血清加入表面已覆蓋免疫球蛋白抗體的96 孔盤中，靜置反應後，再加入標有呈色酵素的抗體作用，最後加入呈色劑並與標準值對照，經由可見光吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度。 RID 方法為：將血清放入培養孔中，靜置24 至48 小時後，再測量其直徑大小，與標準值對照，算出免疫球蛋白濃度。 過敏原誘發的特異性抗體產生利用免疫呈色反應法測定抗原特異性免疫球蛋白濃度：將血清加入表面已覆蓋過敏抗原的96 孔盤中，靜置反應後，再加入標有呈色酵素的抗小鼠IgE、IgG1、IgG2a 等抗體作用，最後加入呈色劑並與標準值對照，經由可見光吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度。 脾臟細胞或是淋巴結細胞的細胞增生反應 細胞增生能力即指免疫細胞受到刺激時，能夠增生的能力。故增生能力之表示，以添加裂殖素 (mitogen) 後，細胞增生能力的數值為未添加裂殖素時數值的倍數，稱為增生指數(Stimulation Index)，簡稱S. I.。 本實驗的細胞增生的刺激物須包括過敏原和裂殖素，T 細胞須以過敏原刺激培養，另可使用如ConA、PHA 等裂殖素或抗CD3 抗體的刺激劑，以分析T 細胞的增生反應。 B 細胞可使用如LPS 來刺激，分析B 細胞的增生反應。 步驟： 3H-thymidine 嵌入法 本方法較靈敏，將脾臟細胞以適當細胞濃度 (例如2x106/ml)置於96 孔盤，再加入RPMI 培養基或分別添加有過敏原、LPS、Con A、或PHA 等細胞裂殖素的培養基。於37℃ 二氧化碳無菌培養箱培養適當天數（例如天）後，加入1 μCi/well 3H-thymidine，繼續培養適當時間之後，以細胞收集儀收集細胞於濾紙上，濾紙風乾後以閃爍計數儀測3H-thymidine 含量，計算細胞增生能力。 MTT 法或WST 等其他類似呈色法 MTT 的測定方法，是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，細胞數與吸光值的直線相關有飽和現象，吸光值無法代表細胞數值，以致較3H-thymidine法不靈敏，進行本實驗時應特別注意其準確度。 WST-1(4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzenedisulfonate) 對細胞無毒性，其作用之原理同MTT assay，但最大的差異為MTT 最後形成的是非水溶性formazan，WST-1 形成的則是水溶性的，因此不需使用有機溶劑回溶結晶，在分析上較為便利。 螢光流體計數儀流式細胞儀來測定DNA 的染色 利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激，細胞核內的DNA 是否有任何變化，以利用bromodeoxyuridine (BrdU) 的方法來