生物分离-双水萃取实验指导.doc

双水相萃取相图的绘制 1．实验目的 ⑴掌握绘制双水相相图的方法 ⑵理解双水相形成条件和定量关系 2．实验原理 双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。双水相形成条件和定量关系常用相图来表示（见图1）。成相物质都能与水无限混合，当它们的组成位于曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B点表示，T、B点称为节点。直线TMB称为系线，是相图的重要特征，关系到相的平衡组成。所有组成在系线上的点，分成两相后，其上下相组成均分别为T、B，但是其体积比（VT/VB）不同。相体积比可由相图上线段比（BM/MT）估算，即服从杠杆规则。本实验绘制PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。 PEG1000原液（0.6g/m%，密度1.054）PEG2000原液（0.g/mL，密度1.02）硫酸铵原液（0.g/mL，密度1.2）2.0mLPEG原液，加入25 mL具塞刻度试管中，然后逐滴加入硫酸铵原液，混合，直至试管中开始出现混浊为止，记录加入硫酸铵量，算出PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度，再向试管中加入适量水（0.2~0.5~1.0 mL），使体系变澄清，记录加入水的量，并继续加入硫酸铵，使体系再次变混浊，如此反复操作二十几次，计算达到混浊时PEG和硫酸铵在系统中的质量百分含量，得出不同相对分子量的PEG和硫酸铵的双节线相图节点。 以上述试验所得结点绘制出不同相对分子量的PEG/(NH4)2SO4体系 PEG质量（g） 体系中盐溶液（mL） 盐质量（g） 体系加水量（g） 体系总质量（g） PEG质量分数（w/w） 盐质量分数（w/w） 1 0 2 0.3 3 0.5 … … … … … … … … n 1.5 双水相萃取牛血清白蛋白 1．实验目的 ⑴掌握PEG/无机盐体系pH值等。 3．实验材料及仪器 PEG1000原液（0.6g/m%，密度1.054）PEG2000原液（0.g/mL，密度1.02）硫酸铵原液（0.g/mL，密度1.2）（μg/mL，pH8.0）紫外可见分光光度计标准曲线的绘制：按下表加入试剂。摇匀。放置2min后测定595nm吸光度值。以蛋白（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘出标准曲线。 （μg） mL PEG储液和4mL硫酸铵溶液于干燥的10 mL刻度试管中，再加入1 mL牛血清白蛋白溶液，混匀，以少量蒸馏水调节体系总质量为10g，混匀，静置15min，读取上下相体积及总体积，再将其倒入分液漏斗使上下相分开，并分别测上下相蛋白浓度。 有关计算公式：分配系数m=Ct/Cb ,相比R =Vt/Vb，萃取率Y=目标相中的蛋白量/上下相中的总蛋白量。 数据处理 5.1牛血清白蛋白标准曲线 5.2 不同相对分子量PEG/(NH4)2SO4体系PEG平均分子量 分配系数 相比 萃取率 1000 2000 6.思考题 ⑴如何利用双水相相图控制相比？ ⑵PEG平均分子量及浓度、(NH4)2SO4浓度、pH值等PEG/无机盐体系pH值、等。 3．实验材料及仪器 PEG1000原液（0.6g/m%，密度1.054）硫酸铵原液（0.g/mL，密度1.2）（μg/mL，pH7.5））紫外可见分光光度计标准曲线的绘制：按下表加入试剂。摇匀。放置2min后测定5nm吸光度值。以（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘出标准曲线。 （μg） mL PEG储液和5mL硫酸铵溶液于干燥的10 mL刻度试管中，再加入1 mL中性蛋白酶液，混匀，以少量蒸馏水调节体系总质量为10g，混匀，静置15min，读取上下相体积及总体积，再将其倒入分液漏斗使上下相分开，并分别测上下相酶活力。 1 mL上相或下相酶液(先于40℃水浴中预热3分钟)，加入1 mL 酪蛋白溶液（先40℃预热3分钟），摇匀，在40℃水浴中精确反应10min，立刻加入3mL 三氯醋酸，摇动，静置10min，滤纸过滤，用小试管收集滤液，放置10min。测A275。并作对照 有关计算公式：分配系数m=Ct/Cb ,相比R =Vt/Vb，萃取率Y=目标相中的蛋白量/上下相中的总蛋白量。 5.数据处理 5.1牛血清白蛋白标准曲线 5.2 不同相对分子量PEG/(NH4)2SO4体系PEG平均分子量 分配系数 相比 萃取率 1000 2000 6.思考题 ⑴如何利用双水相相图控制相比？ ⑵PEG平均分子量及浓度、(NH4)2SO4浓度、pH值等PEG原液硫酸铵原液PEG原液10 mL具塞刻度试管 4个/组 硫酸铵