基因表达应用示例 通过实时荧光定量PCR技术实现对miRNA靶向物.doc

基因表达应用 通过PCR技术实现对miRNA靶向物mRNAs的相对定量1 导言小RNA（miRNAs）是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA，它们是许多基础的细胞过程中基因表达的主要调节因子，这些过程包括细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡等。miRNA在肿瘤生长过程中也发挥着重要作用。一般来说，miRNA通过控制翻译过程来实现对目标蛋白表达的调控。然而，在靶向mRNA降解水平上的基因表达的调控已有报。因此，有证据显示miRNA能够通过RNA降解来实现对细胞内mRNA浓度的直接调控，而且也会通过靶向作用于蛋白质级联来调控mRNA水平，这些蛋白质级联能够调控下游转录或在转录后对mRNA水平进行调控。在当前的研究中，我们重点关注miRNA hsa（人）miR-21，研究发现在乳腺癌和其他肿瘤中miR-21水平上调。更进一步的研究发现，miR-21在细胞凋亡和细胞生长过程中也发挥着功能性作用。为了进一步对miR-21进行研究，我们研究了miR-21的水平对三个的miR-21靶向基因PDCD4，PTEN和TLR2）mRNA表达的影响（见图1）。  2 材料和方法细胞培养 DMEM培养基中补充1%的L-谷氨酰胺，1%的盘尼西林/链霉素，10%的FBS，在+37℃ 5%CO2条件下培养HeLa细胞。用miRNA 21 miRIDIAN类似物，miRNA 类似物miRIDIAN对照，miRNA 21 mi RIDIAN抑制剂和miRNA miRIDIAN抑制剂对照siRNA（dhar-macon都为50nM），以及X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司），按照生产商的方案进行转染。 RNA提取与逆转录 在转染之后两天，使用High Pure RNA Isolation Kit（罗氏公司），按照生产商的建议从HeLa细胞中提取总RNA（每个类似物miRNA三个生物学复制）。同时，使用High Pure miRNA Isolation Kit（罗氏公司），按照使用说明书上的指导，提取包含小分子量RNA在内的总RNA（两个生物学）（见图2）。按照生产商的指导，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（罗氏公司）和oligo（dT）18与随机六聚体引物的混合物，按照每次反应500到1000ng总RNA的量进行第一链cDNA的合成。用miRCURY LNA First-strand cDNA Kit（Exiqon）进行miRNA 第一链cDNA的合成，每次反应使用4ng含小RNA在内的总RNA。qRT-PCR 基因表达分析 在384孔板上11ul/孔的总反应体积中，使用荧光Universal ProbeLibrary（UPL）探针（罗氏公司）和ABI 7900HT 实时仪器（）以及2X FastStart Universal Probe Master （Rox）PCR试剂（罗氏公司）进行定量RT-PCR。每次反应的 cDNA/RNA浓度为10ng。ABI 7900HT实时仪器（）的PCR条件如下：+95℃下变性15分钟，+95℃下扩增15秒，最后在+60℃下延伸60秒。 miRNA定量 LightCycler? 480实时荧光PCR仪（罗氏公司）， 384孔板反应体积为20ul1:10梯度稀释cDNA，在miRCURY LNA SYBR Green master mix，miRCURY LNA内源性对照SNORD44和miR-21的LNA PCR引物（Exiqon）的共同作用下进行miRNA qRT-PCR. LightCycler? 480仪的PCR条件如下： 95℃变性10分钟， 95℃10秒，60℃延伸20秒40个循环。使用△△Ct方法（Livak 和Schmittgen，2001年），用HPRT1和GAPDH作为参考（管家基因）基因，靶向基因表达水平上的变化。对于has miR-21，用非向合成物-和抑制剂-miRIDIAN作为miRNA转染HeLa细胞实验对照。 图2：用指定试剂（miRIDIAN miRNA物或miRIDIAN miRNA抑制剂）转染HeLa细胞后，用Agilent生物分析仪对来自不同细胞集群的小分子量RNA进行凝胶电泳。 3 结果和讨论为了分析miR-21水平升高对靶向基因（PDCE4，PTEN和TLR2）的mRNA水平的影响，我们使用通用探针库探针（罗氏公司）和ABI 7900HT实时仪（）对已经报道的能够被miR-21调控的一些mRNA的丰度进行了定量测定。使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（罗氏公司），用miR-21的物和抑制剂对HeLa细胞进行转染，并分别（miRNA 21 miRIDIAN物