实验二十发酵性豆制品中黄曲霉毒素B1的产生与检测.doc

实验二十、食品中黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B1ELISA 方法测定粮食及食品中黄曲霉毒素B1ELISA 的工作原理，正确熟练使用酶标仪。 二、实验原理： 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B11、 AFB116孔×6条形带框酶标板；2、抗体；3、酶标二抗；4、空白对照液；5、底物（1mg×4）；6、底物液A；7、底物液B；8、终止液；9、PBS一T洗液；10、一次性手套（2副）。AFB1的提取1． 大米和小麦（脂肪含量＜3.0％ 样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250m1具塞锥形瓶中。准确加人60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液（相当4.0g样品）于75mL蒸发皿中。65℃水浴通风挥干。用2.0mL甲醇一PBS 20+80 分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测。此液每毫升相当2.0g样品。2. 玉米（脂肪含量3.0～5.0％）20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中。准确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min。用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取10.0mL 4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加人100.0mL甲醇水 55 45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下按“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 4．植物油4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水 55 45）溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精炼油4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇水溶液于750mL蒸发皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。 5．其它食品：可按照G8 5009有关章节提供的方法操作，最终提取物（相当于4.0g样 2.0m1甲醇一PBS 20＋80 中。 1、将下列试剂稀释后备用 PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）； A: 9mI蒸溜水稀释（1:9）； : 7.0mL洗液稀释（1:140）； :10mL洗液稀释（1:200）:200μl抗体十200μl空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置。 2、抗体抗原反应 PBS）在玻璃试管内混合振荡后室温 15分钟。启封酶标板，用洗液2×3分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体抗原反应液及空白对照液（3孔）和阴性对照液（3孔）,130μl／孔,37℃湿盒中孵育（或加盖以保持相对湿度），2小时后，倒掉反应液并拍干,用洗液3×3分钟洗板，拍干。 3、酶标记反应 100μl／孔，37℃盒中孵育1小时后，用洗液5×3分钟洗板，拍干。 4、显色反应 lmg底物十2.5m1底物液A 42μl底物液B，待底物充分溶解后加入酶标板，100μl／孔，37℃15分钟后加终止液40μl／孔。 5、测定 490nm测定各孔0.D值。 1、求出各孔的0.D校正值：0.D校正值＝O.D实测值一空白对照孔0.D值（均值）。 20.D％值：0.D％＝[O.D校正值/阴性对照孔0.D校正值（均值）］ × 100％。 3、求出待测样AFB1ng／g）：0.D％值（座标Y值）的对应点，该点座标X值的反对数（10xAFB1的含量（ng／g），见图1。1、带手套操作。酶标板用后处理，不能重复使用。样品提取过程中用过的玻璃仪器需要重复使用时，应作解毒处理后,再洗涤。 2、操作时应手持酶标板板框，避免液体等沾污板底部，以保持酶标洁度。 3、试剂盒如需分次使用，应在每次使用前根据用量稀释试剂，每次用多少稀释多少，剩下的酶标板和试剂，应及时封存，4℃保存备用。如需保存较长时间则应-20℃保存。 4、结果判定：根据参考资料三：现行国家食品（饲料）卫生标准中规定的AFB1允许量标准对检测样品A