实验八病毒真菌及其它微生物.doc

实验八 病毒、真菌及其它微生物 【目的】 ①熟悉包涵体、立克次体、支原体、衣原体包涵体、钩端螺旋体、白念珠菌、皮肤癣真菌等形态及结构。 ②熟悉病毒形态特征、对细胞的致病作用以及常用的病毒检测方法。 ③了解浅部真菌的检查法。 一、病毒、真菌及其它病原微生物形态观察 材料名称 染色方法 形 态 特 征 皮肤癣真菌 乳酸酚棉蓝　　蓝色的大小分生孢子、菌丝呈螺旋状球拍状鹿角状结节状等 白念珠菌 同上；革兰　　G＋、芽生孢子成群存在、假菌丝、厚膜孢子 新生隐珠菌 墨汁涂片　　　圆形或卵圆形的透明菌体有芽管、细胞外有宽厚透明荚膜 放线菌 革兰染色　　　G＋、棒状长丝状、无隔有分支呈链銶状链杆状； 0 脓汁中找到“硫磺颗粒”呈菊花状由棒状菌丝呈放射状排列 青霉菌 乳酸酚棉蓝 蓝色的大小分生孢子、菌丝 钩端螺旋体 Fontana镀银0 棕褐色菌体呈C、S状 梅毒螺旋体 Fontana镀银0 棕褐色菌体两端尖直 恙虫病立克次体 Giménez染色0 宿主细胞内外呈暗红色形似小杆菌 支原体 Giemsa染色0　紫蓝色有球形、杆形、分支丝状等 沙眼衣原体包涵体　 Giemsa染色0　浅蓝色的细胞浆中深蓝色的包涵体有散在型帽型桑椹型填塞型 狂犬病毒包涵体　　 苏木精伊红 神经细胞内嗜酸性包涵体呈红色圆形或椭圆，数量1个或多个 病毒等电镜照片 病毒大小、形态，是否有包膜、刺突；核衣壳对称类型 【方法】 显微镜下观察以上各种标本片，观察结果并绘图。 二、真菌培养物观察 【材料】 酵母型菌落、类酵母型菌落、丝状菌落。 【方法】 观察几种菌落的特征： ①酵母型菌落：与细菌菌落相似，圆形，表面光滑，湿润，柔软而致密，乳白或奶白色。 ②类酵母型菌落：菌落表面同酵母菌落，在菌落根部有假菌丝伸向培养基内生长乳白色。 ③丝状菌落：是多细胞真菌的菌落方式，由许多疏松的菌丝体构成，菌落呈棉絮状、绒毛状或粉末状，菌落中央有皱褶，外围有放射状沟，多为茶褐色。 三、酶联免疫吸附试险 ELISA －检测HBsAg 【原理】 酶联免疫吸附试验是一种用酶标记抗原或抗体，以提高抗原抗体反应灵敏度的免疫学检测方法。此处介绍ELISA双抗体夹心法检测HBsAg。 【材料】 ①HBsAg酶标试剂盒：已包被抗-HBs微量反应板、酶标抗-HBs、阳性控制血清、阴性控制血清、酶底物A、酶底物B、中止液、洗涤液。 ②待检血清。 ③微量加样器、吸头等。 【方法】 ①于已包被微量反应板试验孔中加待检血清50μl，每份血清加二孔。每块板做阳性、阴性及空白对照各一孔。 ②每孔中各加酶标抗-HBs 50μl 一滴 。 ③置37℃温箱20min。 ④甩干微孔中液体，每孔均加满洗涤液15秒后甩干，反复洗涤5次。 ⑤每孔中各加显色剂A液和B液（底物）各50μl，置37℃温箱避光15min。 ⑥每孔各加终止液一滴，终止反应。 ⑦观察显色反应或用酶标仪在490nm处，测定其OD值。 【结果判断】 ①肉眼判断：反应孔呈棕黄色为阳性结果，无色为阴性结果。 肉眼判断时，待检孔颜色与阴性对照孔颜色相同或更浅，判为阴性；待检孔颜色明显加深，判为阳性。“－”为无色，“＋”为浅黄色，“＋＋”为黄色，“＋＋＋”为棕黄色，一般呈“＋＋ ”以上者为阳性。 ②用酶标仪检测时，以空白孔调零，先测阴性对照OD值 N ，再测待检孔OD值 P ，当P/N≥2.1 时，判为阳性；≥1．5为可疑；P/N＜2.1时，判为阴性。 结果记录与分析： 四、病毒的分离与鉴定——病毒的鸡胚培养法 鸡胚是正在发育中的个体，有多种可供选择的囊腔及囊膜。可根据病毒种类不同接种于鸡胚的不同部位，如绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔及卵黄囊等。 【材料与设备】 ①鸡胚蛋、牛痘病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、流行性乙型脑炎病毒液。 ②孵卵箱、检卵灯、卵盘、磨卵器、注射器、吸管、剪刀、镊子、碘酒、乙醇等。 【方法与结果】 1 鸡胚的孵育：选蛋壳色浅的来亨鸡受精卵，孵卵（温度38～39℃，湿度40％60％ 2 接种与收获： 鸡胚接种示意图 七、病毒、真菌及其它病原微生物的观察结果绘图 狂犬病毒包涵体 恙虫病立克次体 钩端螺旋体 支原体 沙眼衣原体包涵体 皮肤癣真菌 白念珠菌 新生隐珠菌 病毒、真菌及其它病原微生物 【思考题】 1.真菌有哪几种菌落形态？ 2.哪些病原体感染组织细胞可形成包涵体？ 3.病毒血凝与血型检测中的血球凝集有何不同？ P/N 标本OD值 － 空白对照OD值 阴性对照OD值 － 空白对照OD值