免疫学课件——第九章标记技术分解.ppt

第九章 标记技术 在凝聚性试验中,由于影响因素太多,有时难以出现预期的结果,试验的精确度也不高. 有一些物质在超微量时,就能用某种特殊理化因素将其检查出来.如果将这些物质标记在抗体分子上,就能利用抗体与抗原结合的特性,将抗原检查出来,这就是免疫标记技术. 标记技术目前有:荧光抗体技术,酶标记抗体技术,同位素标记抗体技术,铁蛋白标记抗体技术. 特点:高灵敏度,可以定性,定量,定位测抗原. 一.荧光抗体技术 荧光素在10-8超低浓度时,仍然可被短波光激发,发出明亮的,肉眼能够感知的荧光. 免疫试验用到的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC),四乙基罗丹明(RB200),四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC).其中应用最广的是异硫氰酸荧光素,为黄色结晶状粉末,分子量389,有Ⅰ,Ⅱ两种异构体,易溶于水和酒精,性质稳定,低温干燥可保存多年,能与蛋白质良好结合,异构体Ⅰ效果更好,它的最大吸收光谱为490-495纳米,最大发射光谱为520-530纳米,呈明亮的黄绿色荧光. 一.荧光抗体的制备 ★免疫动物 ★抗体提纯 盐析,分子筛层析,离子交换层析,亲和层析 ★荧光素标记 以直接法为例,在0.5MpH9.5的的碳酸盐缓冲液中稀释IgG浓度至2％,取相当于蛋白质量1/100—1/150的FITC溶于相当于IgG溶液量1/10的pH9.5碳酸盐缓冲液中,将FITC溶液在磁力搅拌下,缓慢加入抗体溶液. 标记抗体的提纯 除去游离荧光素,除去过度标记和未标记上的抗体,除去特异交叉或 不希望的标记抗体. ★荧光抗体的鉴定 化学鉴定 染色滴度测定:特异性染色滴度,非特异性染色滴度. 染色特异性鉴定:吸收试验(标记抗体中加抗原),抑制试验(标本片中加抗体) 2.抗原的检测 标本的制备:涂片,压片,切片 染色: *直接法 *间接法:双层法和夹层法 双层法:待测抗原,标准抗体,标准标记抗抗体 夹层法:待测抗体,标准抗原,标准标记抗体 *抗补体染色法:待检抗原,标准抗体,补体,标记的抗补体抗体. *特殊染色法 双重染色:用两种不同的荧光素标记抗体 反衬染色:伊文氏篮作底色 3.荧光显微镜检查 激发滤光片,屏障滤光片 二.免疫酶技术 滴加底物溶液后底物可以在酶的作用下显色或使底物溶液中的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,呈现颜色反应.少量的酶可促使大量的催化过程,极为敏感.将酶标记在抗原或抗体分子上,就将酶的灵敏性和免疫反应的特异性结合起来.有色产物可以通过肉眼,显微镜或分光光度计观测出来. 特点:定性,定量,定位检测抗原 应用的酶有:辣根过氧化物酶,葡萄糖氧化酶,碱性磷酸酶,酸性磷酸酶,β半乳糖苷酶. 1.免疫酶技术的类型 免疫酶沉淀技术 免疫酶定位技术 免疫酶组化染色技术和免疫电镜技术 免疫酶测定技术 液相测定技术和故相测定技术 液相法 故相法 2.抗体的酶标记 酶标记:戊二醛法与过碘酸钠法 酶结合物的提纯 酶结合物的鉴定 酶和抗体活性的鉴定 结合物定量测定 酶结合物的保存 小量分装,-20℃保存,或在33％的甘油溶液中4℃保存. 3.免疫酶技术操作 免疫酶组化染色法(定性,定位) 标本的处理和制备:切片,压片,涂片等. 消除内源酶,消除背景染色. 染色方法: *直接法:待检抗原,酶标抗体,底物和供氢体 *间接法:待检抗原,抗体,酶标抗抗体,底物和供氢体 *抗抗体搭桥法:待检抗原,抗体,抗抗体,抗酶抗体, 酶与底物及供氢体 *杂交抗体法:待检抗原,酶标杂交抗体,酶与底物及 供氢体 *增效抗体法:待检抗原,酶标抗体,抗抗体,抗酶抗体,酶与底物 及供氢体 *酶—抗体法:(PAP法),与抗抗体搭桥法相似. 显色反应及标本观察 酶联免疫吸附测定法ELISA(定性,定量) 将抗原或抗体吸附于固相载体上(聚苯乙烯微量滴定板),在载体上进行免疫酶染色,底物染色后用肉眼或分光光度计判定结果. 抗原或抗体的包被 将抗原或抗体吸附于故相载体表面的过程. 为了增强包被能力可采取以下方法: 鞣酸处理 牛血清白蛋白,戊二醛处理 改变载体表面的电荷,如聚赖氨酸处理 引入化学基团 封闭载体表面残留的活性部位 牛血清白蛋白 洗涤 每一步都需含吐温20的PBS洗液冲洗 染色方法: *间接法:标准抗原,待检抗体,酶标抗抗体,底物及氢供体 *双抗体法:抗体,待检抗原,酶标抗体,底物及氢供体 竞争法:抗体,待检抗原和酶标记的标准抗原,底物及供氢体.本发测 定小分子抗原及半抗原. 双夹心法:抗体1,待检抗原,抗体2,酶标抗抗体