发酵过程控制3技术总结.ppt

丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素 磷酸戊糖途径（HMP）关键酶 磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6－磷酸葡萄糖脱氢生成6－磷酸葡萄糖酸内酯。 6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析 由图可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6－磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。 三羧酸(TCA)循环的关键酶 三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。 柠檬酸合成酶时序分析 从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。 丙氨酸脱氢酶的时序分析 在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。 结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量 （三）与产物合成相关的酶和中间物测定 例：螺旋霉素生物合成的代谢研究 图3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径 图1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图 哪个代谢中间物过多积累 在发酵后期有FO-Ⅱ积累， 要减少FO-Ⅰ转化为FO-Ⅱ必须降低C3酰化酶的活力，但这与SPⅡ、SPⅢ合成有矛盾 在发酵结束时， SP-Ⅰ还有一定的积累，如能最大限度的转化为SP-Ⅱ、SP-Ⅲ，即加强步骤3对发酵效率和发酵效价是有积极意义的。而FO-Ⅱ、NSP-Ⅱ的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤4的通量。但由于这几个步骤的转化都是由C3酰化酶催化反应，这给改变通量带来一定的困难。 图2 有机酸前体的动态流量分布图 在图2中，乙酸和丁酸在从40小时开始积累并在64小时达到最高值，对照图3螺旋霉素生物合成代谢网络途径[9]，我们可以推测在发酵中前期在图3中的步骤1也即大环成环步骤有一定程度的“瓶颈”影响，从而导致乙酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺旋霉素的效价。 我们测定了内酯环合成相关的酶活——前体的活化 酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势 测定酶活并建立酶活趋势曲线。 分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期,但出现的时间相差很大。 酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期 酰基CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后期。此外，酰基CoA合成酶的活性远小于酰基激酶的活性。 图1 酰基激酶和酰基CoA合成酶活性趋势 酰基激酶 酰基CoA合成酶 酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，推测其参与了初级代谢；后一个活力峰出现在发酵中期，且与酰基CoA合成酶的第一个活力峰出现时间相一致，意味着酰基激酶对次级代谢同样有着重要作用。在螺旋霉素的生物合成中，酰基CoA合成酶的活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶主要参与次级代谢。由于合成酶的活性较小，推测其可能是大环合成的“瓶颈”，如果提高其活性，就有可能大幅度提高发酵效价。 采取措施：寻找酶的激活剂 添加ZnSO4、MnCl2、CoCl2、CuSO4等无机盐，研究了Zn2+、Mn2+、Co2+、Cu2+等二价阳离子对两种酶的影响。 体外各阳离子对酶活性影响，确定了各阳离子对两种酶的最佳添加浓度（表1）。 Control Co2+ Zn2+ Mn2+ Cu2+ 图2 二价阳离子对酰基激酶活性的影响 Control Co2+ Zn2+ Mn2+ Cu2+ 图3 二价阳离子对酰基CoA合成酶活性的影响 在最佳浓度下，各离子对两种酶的影响程度如图2、3所示。对于酰基激酶，