抗ENA抗体检测试剂盒（酶联免疫斑点法） .doc

抗ENA抗体检测试剂盒——斑点法（5人份） 用途： 斑点法检测抗可提取性核抗原（Extractable Nuclear Antigen，ENA）抗体，辅助诊断和鉴别风湿性疾病。 临床意义及检测原理： 自身抗体的检测对风湿性疾病的诊断有重要意义，其中某些抗体还同疾病活动性相关，因此可指导临床用药和评估疾病的预后。可提取性核抗原，其主要成分包括Sm、nRNP/Sm、SSA、SSB、Scl-70 和Jo-1等抗原，相应抗体的检测对于风湿性疾病的诊断和鉴别诊断有极为重要的意义。如抗Sm 、抗Scl-70、抗Jo-1抗体分别为系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬化症（SSc）和多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）的标记抗体。抗nRNP抗体常与雷诺症状相关，其高滴度有利于混合型结缔组织病（MCTD）的诊断。抗SSA、SSB抗体与口、眼干燥症状密切相关。 抗ENA抗体的检测采用斑点法（Dot Enzyme Linked Immunosorbent Assay，Dot-ELISA），试剂盒中载片上每个反应区内固定了2条实验膜条。膜条上平行包被了经亲和层析纯化的Sm、nRNP/Sm、SSA、SSB、Scl-70 和Jo-1 六种抗原。在第一次孵育时，已稀释的病人样本与膜条上的抗原反应。如果样本阳性，特异性的IgG抗体将与相应的抗原结合。为检测已结合的抗体，加入酶标抗人IgG （碱性磷酸酶结合物）进行第二次孵育，然后加入底物液以产生蓝紫色颜色反应。 试剂盒组成： 名称 规格 数量 ENA检测斑块 5人份/张 1张 ENA酶标二抗 10× 50μl /支 1支 浓缩洗液（10×） 20ml/瓶 1瓶 ENA底物液（直接使用） 500μl/瓶 1瓶 产品说明书 1份 1份 ENA检测斑块：直接使用。为防止斑块包被有抗原的一面发生冷凝，只有当载片平衡到室温方可打开铝箔袋。不要让手或其它物品接触到斑块。不要使用铝箔袋破损的载片。一旦打开铝箔袋，应立即温育。 ENA酶标二抗（10×）：使用时用洗液1：10倍稀释。工作浓度的ENA酶标二抗应在24h内用完。 浓缩洗液（10×）：使用时用蒸馏水1：10倍稀释。工作浓度的洗液应在一周内用完。 ENA底物液：直接使用。因对光敏感，使用后应立即盖紧瓶盖。 标本的采集处理和保存： 待测标本最好是新鲜采集的病人血清或血浆，若当时不检测，可将血清或血浆分离出来，置2℃～8℃冷藏保存，一周内检测结果仍然可靠。若标本中有微粒可低速离心后取上清检测。 操作步骤： 准备：ENA检测斑块从冰箱取出后，等待其恢复至室温后再剪开包装。将浓缩洗液（10×）用蒸馏水溶解至200ml，混匀后作洗涤和标本稀释用。 稀释：待测血清用洗涤液作1：101稀释（如可取10μl血清用1ml洗液稀释混匀）。 加样：在倒扣板的反应孔内加入稀释好的血清，50μl/孔。注意：加样时避免产生气泡。 孵育：将ENA检测斑块盖在倒扣板对应的凹槽里，在120-140rpm旋转摇床上室温孵育30min。注意：确保每个标本均能够与斑块相接触，而标本之间不相互接触。 洗涤：取出ENA检测斑块，用洗涤液轻轻从一侧将反应液冲洗掉，浸泡至洗片缸内，静置10 min。 加样：在倒扣板的反应孔内加入用洗液1：10稀释的ENA酶标二抗，50μl/孔。注意：加样时避免产生气泡。 孵育：ENA检测斑块，盖在倒扣板对应的凹槽里，在120-140rpm旋转摇床上室温孵育30min。注意：确保每个标本均能够与斑块相接触，而标本之间不相互接触。 洗涤：重复步骤5 。 加样：滴加50μl底物液于加样板的每个反应区内。注意：加样时避免产生气泡。 孵育：ENA检测斑块，盖在倒扣板对应的凹槽里，在120-140rpm旋转摇床上室温孵育10min。注意：确保每个标本均能够与斑块相接触，而标本之间不相互接触。 洗涤：用去离子水或蒸馏水冲洗ENA检测斑块，自然干燥15min。 结果观察：肉眼观察反应区内各抗原带有无着色及着色深浅。 结果判断： ENA检测斑块抗原及其排列如下： 注意：各抗原带位置可参考此图，左面模块抗原条带位置与右面模块抗原条带位置并不完全平齐。 根据斑块上各抗原带着色的深浅来判断结果。注意：必须在斑块彻底干后才能判断结果。质控带出现明显的阳性反应说明实验结果可靠。与非抗原包被区域相比，阳性反应将在相应抗原线处出现明显的蓝紫色条带。 根据抗原带着色深浅，可将结果分为阴性、临界阳性和阳性。 抗原带着色的深浅 结果 无色 阴性 着色非常弱 临界阳性 着色明显 阳性 使用注意事项： 本试剂盒只做定性检测。 检测斑块质控带必须显色否则试验不成立。 使用前试剂应摇匀。 显色液请尽量避免皮肤直接接触。 每个ENA检测斑块共5人份，拆开包装膜后应尽快使用。 不同批号的试剂不可混用。 对照血清