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Keylab of Medicine School of Su Zhou University 流式细胞术及临床应用 吴林军 乐山市中医医院检验科  FCM 的结构一般分为5 部分： ①流动室及液流驱动系统； ② 激光光源及光束成形系统； ③ 光学系统； ④ 信号检测、存贮、显示、分析系统； ⑤ 细胞分选系统 ? 流动室及液流驱动系统 液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。 鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，操作人员无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。如下图。 因此，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。 激光光源与光束成形系统 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光（light amplification by stimulated emission of radiation , Laser）是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1 微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。 光学系统 FCM 的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器 在FCM 的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3 类：长通滤片（long-pass filter, LP）、短通滤片（short-pass filtr, SP）及带通滤片（band-pass filter, BP）。 信号检测与分析系统 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360 度立体角发射，产生散射光和荧光信号。 （1）散射光信号：散射光分为前向角散射（forward scatter,FSC）和侧向角散射（sidescatter,SSC），散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数 ① 前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM 应用中，选取FSC 作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。 ② 侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90o 方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。 （2）荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量 流式细胞仪产生的信号 非荧光信号 上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图（图3-2）为FSC和SSC组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。 FCM 测量数据的存贮、显示和分析 目前FCM 数据的存贮的方式均采用列表排队（list mode）方式。因为目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。 流式细胞仪临床应用 流式细胞术： 是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞特异性标记荧光信号而测定细胞的多种生物物理性质的方法，同时也是一项可以把具有某相同荧光信号特