实验步骤- Wstern bloting 实验流程 (2012-5临床医.docVIP

Western blotting实验流程 实验流程共分为6步： 1 待测蛋白的准备； 2 蛋白电泳； 3 转膜； 4 抗体结合； 5 曝光； 6 灰度值统计分析。 一、待测蛋白的准备 细胞蛋白的提取： （1）拿出六孔培养板，去培养液，PBS洗细胞两遍，根据细胞密度每孔加50~100μl细胞裂解液（含1%的蛋白酶抑制剂PMSF,现用现配），冰上放置10分钟裂解。 （2）将培养板置于冰上，用细胞刮挂下细胞，每孔刮一分钟左右（刮不同孔细胞需用PBS或水冲洗细胞刮，洗后甩干），收集裂解液于1.5ml EP管中，置于冰上裂解20分钟，期间需用振荡器振荡混匀3次，每次15秒左右 （3）12000rpm，4℃冷冻离心5min左右，收集上清置于新EP管，存于-80℃。 2. BCA法蛋白溶液浓度测定（具体步骤按试剂盒说明书） （1）配制BCA工作液：打开37℃恒温箱预热加温，取出BCA标准品与蛋白样品解冻，配BCA工作液，A：B=50：1， A液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*200μl，B液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*4μl，配好后混匀。 （2）配制BCA标准品与标准曲线：用PBS稀释好标准品，按说明书将标准品加入到96孔板中，再补加PBS到一样体积。 （3）配制蛋白样品：每孔加入5μl蛋白原液，补加PBS稀释（稀释可节省蛋白，记住稀释倍数，蛋白较多时也可不稀释直接加蛋白原液测；蛋白孔可做2~3个平行孔，测量时取平均值较准） （4）加入BCA工作液：每孔各加200μl已配好的工作液 ，盖上板盖混匀30秒，37℃孵育30min，放好蛋白样品。 （5）测蛋白浓度：打开酶标仪预热10分钟以上，孵育完后取出96孔板冷却到室温，用移液枪去除小气泡，用纸巾擦干96孔板板度水珠，调节酶标仪波长，放入打印纸，打开96孔板板盖，在570nm波长下读取数值，空白孔可设可不设。（具体按酶标仪操作说明，可以测几次选取） （6）计算浓度：用EXCELL表格制作标准直线方程，计算待测蛋白浓度（若稀释测量的记住要乘以稀释倍数才是最终蛋白浓度），然后以每个条带最低浓度那组蛋白为标准计算各组蛋白上样体积与细胞裂解液RIPA的补加体积。（注意：标准曲线R平方值在0.99以上才可用，每孔蛋白上样量要8微克以上才行。） （注意：用移液枪加液体时可沿96孔板的孔壁加，避免产生气泡影响结果） 二、蛋白电泳 一共分为5步： 1 试剂配制； 2 配胶； 3 蛋白处理 4 加样； 5 跑电泳。 试剂配制 ⑴10%SDS： SDS粉剂 10g 蒸馏水 100ml 磁珠搅拌混匀，常温放置 （室温过低，容易出现絮状沉积，需加热摇匀） ⑵30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺 14.5g 避光磁珠搅拌溶解， N,N’-亚甲基甲叉双丙烯酰胺⑶10%过硫酸铵： 过硫酸铵 0.1g 蒸馏水 1 ml 置于EP管摇匀，4℃避光保存，3日有效期，现用现配最好 ⑷5×电泳缓冲液： Tris碱 15.1g 甘氨酸 94g 10%SDS 5g 磁珠搅拌混匀，常温放置。使用时用 蒸馏水 1000ml 蒸馏水稀释至1X ⑸其它：1.5M Tris（PH8.8）、1M Tris（PH6.8）均用试剂公司产品，常温放置 2. 配胶 ⑴检漏：洗干净玻璃板（不可用刷子刷），上面放好制胶架；板槽放好长条海绵胶；用板夹加紧两块玻璃板（注意两块玻璃板的正反面及左右、底部是否对其，上下是否颠倒，否则容易漏胶）；将板夹固定在板架上（特别注意：要将玻璃板底部在长条海绵胶上用力压一压，使其紧贴海绵胶，否则极易漏胶）；组装好后用枪灌满水检漏，待一段时间后不漏水即可将水倒出并用纸或布吸干边角处 ⑵配置12%分离胶：（例如：按下述方法配制10ml量，可灌两块胶，做大分子蛋白时可配10%等低浓度胶,10%过硫酸铵与TEMED是凝胶试剂，应最后加，加完后立刻灌胶） 蒸馏水 3.3ml 30%丙烯酰胺 4ml 1.5M Tris 2.5ml 用5L移液枪充分混匀 10%SDS 100μl 10%过硫酸铵 1