白花蝴蝶兰类胡萝卜素生合成相关基因转录物多型性之研究.docVIP

白花蝴蝶蘭類胡蘿蔔素生合成相關基因轉錄物多型性之研究A study on the transcript polymorphism of carotenoids biosynthesis related genes in Phalaenopsis amabilis Orchidaceae 研究生：黃俊諺 Huang, Chun-Yen 指導教授：江友中 Chiang, Yu-Chung 蔡奇助 Tsai, Chi-Chu 【摘要】 白花蝴蝶蘭 Phalaenopsis amabilis 為蘭科、蝴蝶蘭屬的模式物種 type species ，其花朵外觀色白僅中央的唇辦 labellum 具有色素的累積而呈現豔麗的亮黃色，該顏色是由類胡蘿蔔素 carotenoids 的累積所造成，而 PSY phytoene synthase , PDS phytoene desaturase , CRTISO carotenoid isomerase , ZDS ζ-carotene desaturase , CCD carotenoid cleavage dioxygenase 與 ChrC fibrillin 等六種酵素為類胡蘿蔔素生合成之關鍵酵素，扮演著類胡蘿蔔素呈色與否之重要角色。本研究以白花蝴蝶蘭之唇辦組織為材料，選殖其 PSY, PDS, CRTISO, ZDS, CCD 與 ChrC 基因，分析其轉錄物的多型性，以供給未來花色改良及花色調控之研究。根據已發表阿拉伯芥 Arabidopsis thaliana 及水稻 Oryza sativa 、玉米 Zea mays 等單子葉物種之 PSY, PDS, CRTISO, ZDS, CCD 與 ChrC 基因序列，設計退化性引子，利用 RT-PCR 方法選殖出預期片段，再配合5’及3’端 RACE rapid amplification of cDNA ends 策略，選殖出所有基因的全長序列；另外利用 Genome Walker 策略進行各基因之基因組 DNA 之選殖，同時將基因組 DNA 序列與轉錄物 cDNA 序列經排序對比後發現：所有基因都有多型性轉錄起始位點 multiple transcriptional initiation sites, multi-TISs 與多聚腺苷酸化位點 multiple polyadenylation sites, multi-PASs 的現象；而 PDS, CRTISO 與ZDS 基因的5’端非轉譯區 UTR 則有差異性剪輯 alternative splicing 的現象；此外，在 PDS 基因的轉錄物當中，有3型外源序列片段接合在5’端非轉譯區前端的反式剪輯 trans-splicing 現象發生。雖然5’端非轉譯區較長的轉錄物擁有多個上游基因開讀框 upstream open reading frames, uORFs 與差異性剪輯 alternative splicing 而截去轉錄物部分主要基因開讀框 primary ORF, pORF 之序列皆會影響基因的轉譯效率與功能，但是PSY, CRTISO, ZDS, CCD 與 ChrC 基因在白花蝴蝶蘭的唇辦組織當中，仍然可以轉錄出有利於 無上游開讀框與差異性剪輯 轉譯作用的轉錄物出來而進行類胡蘿蔔素的催化生成；然而，在 PDS 方面，雖然白花蝴蝶蘭唇辦組織所有的轉錄物都含有主要開讀框的序列全長，但是那些轉錄物全部都含有上游基因開讀框架，大大的影響基因的轉譯效率。白花蝴蝶蘭唇辦組織的 PDS 基因是否能利用反式剪輯轉錄物 無上游基因開讀框 來進行轉譯作用以順利達成類胡蘿蔔素生合成路徑的催化仍需進一步的研究。 白花蝴蝶蘭、類胡蘿蔔素、轉錄起始位點、多聚腺苷酸化位點、差異性剪輯、反式剪輯Phalaenopsis amabilis, a type species of genus Phalaenopsis Orchidaceae , has white flower with bright yellow labellum. The yellow labellum was caused by accumulation of carotenoids, which were metabolized from carotenoid biosynthesis related genes. Six carotenoid biosynthesis related genes, PSY phytoene synthase , PDS phytoene desaturase , CRTISO caroteno