western-blot条带分析及解决方法解析.docVIP

现象 原因 解决 反影(白色条带,黑色背景) 1 HRP过高(背景较高) 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1 显影后膜上条带处变为黄色 2 HRP过高(敏感性太高) 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2 信号弱或无 3 HRP过高引起底物迅速耗竭 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3 4 抗体-抗原系统敏感性过低 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4 5 转膜不充分/过转 优化转膜条件*注5 6 HRP或底物活性降低 测试活性或选用敏感底物 *注6 高背景 7 HRP过高(背景较高) 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7 8 封闭时间不足 延长封闭时间4度过夜最好*注8 9 抗体与封闭液有交叉 更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9 10 TBST洗脱不足 增加洗脱时间、次数、用量*注10 11 暴光时间过长 降低暴光时间*注11 12 抗原-抗体浓度过高 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12 条带内无显影的白点 13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) 精细操作*注13 14 膜平衡不均/油脂污染 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14 15 膜与X光片间有气泡 显影前去除气泡*注15 非特异性条带 16 抗体交叉反应 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16 17 SDS非特异性结合蛋白条带 使用无SDS转膜液*注17 散在小圆斑 18 封闭液有杂质颗粒 静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18 *注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决同上。 *注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来，所以要把握时机）。如果没有达到原因1和原因3的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压10s~30s，甚至可以3~5s，即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况，就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如3s则可因感光不足导致条带太淡，这样就不可取了，但依然是粗大的、非条带的本来面目），那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度（减少上样量很不稳定且能力有限，故很少使用）来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。 *注3 这是与1类似但抗体特异性较好时的一种表现，经常与下面的原因4、5、6混淆，特别需要注意。主要出现在HRP极高的情况下，来不及压片就已耗竭底物，往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定，也可以根据原因2的现象确定，以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧光明显。 *注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述，只提醒一下随抗体浓度增高背景和非特异性可能会增加。关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量，而落实到每一个具体条带（同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳），则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量。(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章)，超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准，因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都跑的很漂亮的极限,而上样超量的表现是随