PFGE原理及参数设置解析.pptVIP

PFGE分型技术和技术参数设置 金东 2010年6月 如果基因事件发生在凝胶之外的片段？ 质粒对图谱是否会产生影响？ 图谱中的条带数目相同但是位置上有差异？ * PFGE原理及相关参数 PFGE原理及相关参数 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度后DNA的迁移速度几乎与分子大小无关。当DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，卷曲的DNA分子在电场作用下会沿电场方向拉伸变形挤过筛孔，凝胶介质的分子筛效应不明显，此时DNA分子在电场中的迁移速度主要取决于电场强度。 有实验证明长度大于40KB的DNA分子不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中分离。 PFGE原理及相关参数 脉冲场凝胶电泳可以分离长至50MB的DNA分子。其原理是DNA分子在交替变换方向的电场中做出反应的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快，因而在凝胶中移动也快，于是不同大小的分子被成功分离。DNA分子在交替电场作用下的行为可以用分子的延展性和沿电场方向平行泳动前的重新定向解释。DNA分子以蠕行（reptation）方式在琼脂糖凝胶的连续孔洞中迁移。当电场变换方向时，DNA分子在新的方向泳动前必须再定向。所以，电场方向有规律地变换，DNA也必须有规律地改变泳动方向。分子越大重新定向需要的时间越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，最终达到了分离的目的。 目前常用的脉冲场凝胶电泳仪器为箝位匀强电场系统（contour-clamped homogeneous electric field, CHEF） 方框代表琼脂糖凝胶，一排长方形小框代表DNA加样孔，六边形代表CHEF系统的电极（4X6）。当电泳工作时，DNA分子以箭头方向迁移。 PFGE原理及相关参数 影响分辨率的因素 影响分辨率的因素包括：脉冲时间、电场夹角、电场强度、电影温度、缓冲液以及电泳时间等。在脉冲场凝胶电泳中通常包括脉冲时间、电场强度、温度、缓冲液组成、琼脂糖类型和浓度以及电场夹角等参数而只是改变脉冲时间来控制分辨样品的范围，即通过增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间来分离较小分子。 脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。 例如：脉冲时间为30s，即电场方向将会在30s变换一次。脉冲时间是脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间为一个范围值如：2－20S。这样是为了使一定范围内的DNA片段都可以得到理想的分离。这种脉冲时间的变换可以是线性的或者是非线性的。线性是指脉冲时间在一定的电泳时间内是均匀变换的；而非线性的变换可以使一定的脉冲时间相对集中，从而使相应大小的片断得到更好的分离。 脉冲时间 脉冲时间—不同脉冲时间对带型的影响 2.2-54.2s 2-30s 2-35s 2-25s 随着大脉冲时间的缩短大片段的位置也在逐渐靠近加样孔，同时小片段也有不错的分离效果。 电场夹角 使用较小的电场夹角可以分离较大的DNA片段，而大的电场夹角分离较小的片段。当使用较小的电场夹角时，小片段会变的相对集中。 大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场夹角为120度。 120° 100° 105° 96° 94° 电场角度 随着电场角度的减少，两个大片段分的更开。但是同时小片段也在逐渐的压缩。所以为了兼顾不同大小的片段需要选择一个合适的电场角度。 2.2 Mb 1.6 Mb 大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场夹角为120。 电场强度 电场强度以V/cm来表示的。因为通常的CHEF型脉冲场凝胶电泳胶区的长度为33cm，所以200V的电压实际上为6V/cm。使用较高的电场强度可以分离较大的DNA片段，反之亦然。 大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场强度为6V/cm。 缓冲液类型 脉冲场凝集电泳中的缓冲液选择需要考虑两方面的问题：缓冲液的缓冲能力以及长电泳时间中液体的损耗问题。 通常用于脉冲场凝胶电泳的电泳缓冲液包括两种0.5XTBE和1XTAE，其中1XTAE常用于MB级的DNA片断的分离（3MB），而0.5XTBE常用于1MB的片断的分离。 电泳温度 脉冲场凝胶电泳通过冷凝以及循环系统实现对电泳缓冲液的温度控制。 当缓冲液的温度越高，电泳所需要的时间也就越短。但是，较高的温度会造成条带弥散，影响分辨率。 通常使用的缓冲液的温度为12℃－15℃。在这个温度内可以最好的兼顾电泳时间和分辨率。 琼脂的种类以及琼脂的浓度 使用的琼脂糖浓度越低，所能分离的DNA片段越大。但是琼脂的浓度低，其机械强度也低，实验操作中的难度也会加大。 在脉冲场凝胶电泳中使用的琼脂糖应当具备以下的特点： 1、机械强度大，利于实验操作 2、纯度高，高纯度的琼脂可提高电泳的分辨率 3、熔点低