PCR技术新进展解析.ppt

1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。 二、PCR的原理： 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling): 突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″ 3. 延伸 (Extension): 将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃ 1′ 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。 三、PCR的成分和作用：终浓度 1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。 2. MgCl2: 1.5 ～ 2.0 mM Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，就会出现红彤彤一片涂布；浓度过低会降低 Taq脱氧核糖核酸聚合酶的活性，使反应产物减少。偏小时也会在产物区出现小涂布。如果在几个其他成份对照组中都出现一样的涂布,则肯定是由于镁离子引起。 若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度脱氧核糖核酸及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。 由于TE可以络合一部分镁离子,所以在用TE替代灭菌双蒸稀释引物和模板时,添加的镁离子的量要稍微高一些; 3. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物 0.02 ～ 0.2 mM dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。 dNTP 的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq 酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。 PCR反应体系中ｄNTP的终浓度为0.2ｍＭ(指每种碱基的浓度)。 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，尤其是注意4种dNTP的浓度要相