protocolfortheextractionofplasmid.docVIP

质粒转化 准备已纯化的质粒和处于感受态的大肠杆菌（大肠杆菌一般为DH-5α，100ul/管） 按比例为（2-10ul）：100ul将质粒加入大肠杆菌内，混匀，冰上孵育30min 42℃水浴热激 两者混合液 90s ，再转入冰上放置2min （将质粒转入大肠杆菌内） 将混合液加入900ul的无抗生素的液体培养基，37℃，震荡培养1h （菌体长出，表达抗性） 用4000rpm离心，3-5min，使菌体沉淀下来，再倒去大部分上清液 用移液枪吹打，将小部分的液体与沉淀混合 涂布法将菌液涂与含抗生素的固体培养基上，37℃，倒置培养15-18h （单克隆菌体长出） 注：菌体培养时间不要过长，防止杂菌长出 质粒的扩增 从已经长出菌体的培养基中挑出单克隆，再转入液体培养基中培养。（也是含抗生素的培养基，一般用10ml培养基培养一个单克隆） 质粒的提取 按照质粒提取盒的方法和步骤操作 细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH Solution II 裂解。SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上