三种草莓病毒的多重RT—PCR检测方法.docVIP

三种草莓病毒的多重RT—PCR检测方法 　　摘 要：目前，草莓主要有3种病毒侵染，本研究通过改进CTAB法对经过茎尖剥离的组培四季草莓叶片提取总核酸，采用多重RT-PCR技术同时检测草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒和草莓镶脉病毒。电泳结果显示提取的总核酸中可见总DNA条带和完整的RNA条带，并采用两步法RT-PCR获得了目的条带。本研究建立了多重RT-PCR同时检测草莓病毒的技术体系。 　　关键词：总核酸；草莓病毒；多重RT-PCR 　　中图分类号：S668.4 文献标识码：A 　　研究报道侵染草莓的病毒有25种之多，在我国草莓生产区，分布广泛、危害严重的主要有草莓斑驳病毒（Strawberrymottle virus，SMoV）、草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus，SMYEV）和草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV） 3种病毒[1]。目前，在生产上，草莓带病毒株率平均为80.2%，单种病毒侵染株率为41.6%，2种以上病毒复合侵染株率为38.6%。目前，利用分子生物学检测草莓的病毒种类是比较普遍的方法，主要是PCR（聚合酶链式反应）技术，已有利用此技术对这3种病毒进行检测的报道[2～4]。草莓病毒多为混合侵染，综合表现症状，利用单一PCR分别对多种病毒进行系统检测的工作量较大。近几年发展起来的多重PCR技术可在1次PCR反应中同时检测多种病毒或鉴定病毒的不同株系，既提高了检测效率又降低了检测成本，是病毒检测的1个重要发展方向。本研究在利用单一RT-PCR分别检测SMoV、SMYEV和SVBV病毒的基础上，探索利用多重RT-PCR同时检测草莓的3种病毒。 　　1 材料与方法 　　1.1 植物材料 　　待检测的四季草莓品种是蒙特瑞保存于组培实验室继代培养的组培瓶中，通过微茎尖培养共获得20个株系，阳性对照草莓为温室大棚中未经处理的蒙特瑞。 　　1.2 试剂 　　TaqDNA聚合酶、DNAMarker、dNTPs和反转录试剂盒为上海生物工程公司产品；CTAB提取液为实验室自配。 　　1.3 引物 　　引物D1/D3、C1/C2、Y1/Y2序列见表1。 　　1.4 核酸提取 　　利用改进的CTAB法提取草莓叶片总核酸[3]。取少许幼嫩的叶片，放入1.5mL离心管中，加入石英砂用研磨杵研磨均匀，直至全部研磨至粉末，加入500uL65℃预热的CTAB溶液（用前加入2%的巯基乙醇），将装有CTAB和样品的EP管放入65℃水浴，约20。冷却后加入500uL的酚、氯仿、异戊醇（25：24：1=300：288：12），混匀，12000r/min，离心15min，吸上清，装入一新的EP管。加入500uL氯仿、异戊醇（24：1=576：24），12000r/min。离心15min吸上清，转入一新的离心管中。加入1/10体积的NaAc（3mol/L），1mL-20℃预冷的无水乙醇，反复颠倒数次，混匀后置于-20℃（-80℃，30min）3～4h，12000r/min，10min弃上清。向离心管中加入75%的乙醇洗涤2～3次，置于吸水纸上倒置晾干。加入DEPC H2O（30uL）溶解。 　　1.5 多重PCR体系的建立 　　SMoV、SMYEV引物参考（Thompson et al.，2003），SVBV引物参考（常琳琳等2009）。 　　1.5.1反转录步骤 　　取5uL总核酸+1uL随机引物+6uL Rnase-free ddH2O，将混合物置于70℃水浴5min后立即冰浴10sec，短暂离心。再将混合物置于冰上，依次加入下列组分： 　　2.2 多重RT-PCR同时检测3种病毒 　　本研究中，作者利用引物D1/D3、C1/C2和Y1/Y2做了大量预实验来同时检测SMoV、SMYEV 和 SVBV，研究中对多重RT-PCR体系中主要的影响因素，如PCR缓冲液浓度、dNTP、Mg2+浓度、DNA聚合酶浓度、引物浓度及循环数进行了优化。在优化过程中，根据产物中目标片段的长短，适当调节PCR缓冲液浓度，将10×PCR Buffer分别调至终浓度为2.5×，2×，1.5×，1×，0.5×几个梯度。本研究中，3个目标片段均属于小片段，而高盐浓度会使长片段扩增逐渐减弱，而短片段扩增逐渐增强，因此对比试验中，2×的效果最佳。此外，调节引物浓度也是影响多重PCR的主要因素，本研究中对引物浓度进行了梯度对比，扩增结果发现，对引物浓度进行的调整引起扩增产物的显著变化，且一种引物浓度过高时容易出现弥散现象，只有在诸多因素最佳条件下，再调节引物浓度才可以起到较好的效果。 　　最终的优化结果为：加入2×PCR Buffer，引物浓度分别为D1/D