蛋白相互作用研究技术简介ForteBio和ITCdoc.docVIP

作者：蛋白化学组?黄毅 ? 　　蛋白质组（proteome）是指一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质。而蛋白质组学（proteomics）是研究蛋白质组的一门新型科学。其中一项研究内容是研究蛋白质之间的复杂相互作用机制，即蛋白相互作用。蛋白质是生命功能的执行者和生命现象的体现者，对蛋白结构功能的研究将直接阐明生命在生理或病理状况下的变化机制，而蛋白质功能的实现离不开蛋白与蛋白、蛋白与其他生物分子之间的相互作用。蛋白质相互作用在绝大多数生化功能中扮演极重要的角色，是细胞，乃至整个生命体生命活动的基础。 ? ? ? 　　蛋白相互作用的研究手段，包括传统技术（酵母双杂交等），高通量技术，体内成像技术以及生物物理技术。在这里我们将着重讲述生物膜层反射光干涉技术（Biolayer Interferometry）和等温滴定量热技术（Isothermal titration calorimetry）。 ? ? ? ? ? ? ? 生物膜层反射光干涉（Biolayer Interferometry）- Fortebio技术 ? 　　Fortebio技术，是一种利用生物膜层反射光干涉（Biolayer Interferometry，BLI）原理的免标记，分子结合特异性检测技术。Fortebio可以同时检测8个样品，拥有多种可供选择的传感器，具有实验分析时间短，分析的样品范围广的优点；可以进行两个分子的亲和力分析、动力学筛选、以及蛋白结合浓度的测定。 ? ? ? ? 　　Fortebio的原理是利用特殊的光学传感器，偶联检测分子。当检测分子与目标分子结合后，由这两种分子组成一个分子层。白光直射入光纤，两束光线将会反射到光纤传感器的末端。第一道光线由传感器内表面反射而来，第二道光线来自于分子层。不同的两束光线将会产生光干涉，并以相位移动的方式被检测，从而检测到结合到传感器表面分子数量的变化。 ? ? ? ? 　　Fortebio技术用来进行多种分子相互作用的检测，例如，小分子化合物筛选、蛋白-小分子亲和力测定、蛋白-蛋白/DNA、蛋白-糖分子、抗体抗原亲和力测定等。 ? ? ? ? ? ? ? 等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry，ITC） ? 　　等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化（吸热或者放热）。当物质结合，热量要么产生，要么吸收。由于ITC直接测量生物分子结合事件中释放或吸收的热量，它便成为在单个实验中直接测定所有结合参数的唯一技术，如化学计量（n）、亲和力（Kd）、焓（△H）和熵（△S）。这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照热力学数据，特别是焓变（?H）和熵变（?S），揭示的是推动复合物的形成和作用机制的力量。热力学提供的信息可表征构象变化，氢键结合，疏水相互作用，以及电荷电荷相互作用。这些信息对于描述在分子水平上的功能和机制是必须的。 ? ? ? ? 　　恒温下，ITC将“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比，结合过程中实时的热量变化可以被精确地记录下来，并进行函数做图，最后通过计算，获得各种热力学数据。 ? ? ? ? ? ? ? ? ITC技术具备以下技术特点和优势： 1.???????对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件。 2.???????样品用量小，方法灵敏度和精确度高：最小可检测热功率2 nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2- 80℃。 3.???????真实的溶液内技术：无需固定或标记任何抗体、无分子量以及缓冲液体系限制。 4.???????实验时间较短：典型的ITC实验只需30-60分钟。 5.???????操作简单：实验由计算机控制，只需输入实验的参数（温度、注射次数、注射量等），计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析数据。 　　ITC作为一种非标记技术，可以真实反映两种物质间反应的热动力学过程，可以用在多种分子间相互作用的测定，包括蛋白与蛋白、蛋白与小分子、小分子与小分子等。 ? ? ? ?