二氢嘧啶脱氢酶活性及5-氟尿嘧啶活性代谢产物测定及其临床应用.docVIP

二氢嘧啶脱氢酶活性及5-氟尿嘧啶活性代谢产物测定及其临床应用 █山东大学齐鲁医院临床药理研究所 李平利 张蕊 郭瑞臣 5-氟尿嘧啶（5-FU）及其前体药物卡培他滨临床常用于乳腺癌、结直肠癌及头颈癌等多种肿瘤的治疗。5-FU进入机体后，80%以上经肝脏二氢嘧啶脱氢酶（DPD）代谢并转化为氟代β-丙氨酸（FBAL），FBAL的代谢产物为氟乙酸（Fluoroacetate）和氟代柠檬酸（F-citrate），是引起5-FU心脏及神经毒性的主要活性物质。部分未经DPD代谢的5-FU在体内转化为具有生物活性的FUTP和FdUTP，通过干扰肿瘤细胞RNA或DNA的生物合成发挥抗肿瘤作用，或转化为FdUMP，与胸苷酸合成酶（TS）、5，10-亚甲基四氢叶酸（CH2THF）形成稳定的三联复合物，抑制TS正常功能，干扰DNA合成，发挥DNA介导的细胞毒性作用（如图所示）。DPD基因（DPYD）存在多态性，不同个体间DPD活性差异较大，甚至部分或完全缺失。DPD部分或完全缺失个体，5-FU常规剂量可导致清除率降低，发生5-FU相关毒性，如粘膜炎、粒细胞减少症、神经性病变，甚至死亡。而DPD高表达个体，则造成5-FU耐受，常规剂量难以达到理想治疗效果。由于DPYD基因存在多个突变位点，或可能存在未知位点，或某些位点功能活性的研究尚不完全，导致已知DPYD基因突变与DPD表型缺乏一致性。因此，DPD活性测定对于5-FU个体化治疗更具重要意义。其他参与5-FU体内生物转化的尿苷磷酸化酶、乳清酸磷酸核糖转移酶、胸苷磷酸化酶等的基因型及活性不同个体间也不完全相同，使产生活性代谢产物FUTP、FdUTP、FdUMP的量存在差异。而FUTP、FdUTP及FdUMP是杀伤肿瘤细胞的直接作用形式，故测定其细胞内浓度可更直接地揭示或预测5-FU的疗效或毒副作用。因此，直接或间接测定DPD活性及5-FU活性代谢产物水平有助于制订、调整、修饰5-FU的给药方案，提高疗效，降低毒副作用，并进一步评价常规5-FU浓度测定的优势和局限性，明确5-FU发挥药效或产生毒副作用的机制。 1. DPD活性测定 DPD活性测定包括表型测定（Phenotype）、基因型测定（Genotype）、蛋白表达及mRNA水平测定。 1.1 DPD表型测定 表型指在环境影响下基因型所发生的机体的物理表现和可见性状，不同表型药物代谢酶的催化代谢活性大小, 可通过测定其底物的代谢率断定。底物可以是外源性探针药物，如异烟肼、氨苯砜、咖啡因等可用于测定N-乙酰基转移酶表型测定，非治疗目的，一次性服用；也可以是治疗药物，如5-氟尿嘧啶，以原形与代谢物比值表示相关酶活性的强弱。 DPD分布于人体多个组织、器官，但主要存在于肝脏，参与80%以上5-FU的肝脏代谢。测定血浆或尿液二氢尿嘧啶（UH2）、尿嘧啶（U）、二氢胸腺嘧啶（THY2）、胸腺嘧啶（THY）、二氢氟尿嘧啶（5-FUH2）、氟尿嘧啶（5-FU）浓度，计算UH2/U、THY2/THY、5-FUH2/5-FU值可间接反映DPD活性。 Ben Fredj等采用高效液相色谱-紫外方法测定9例接受5-FU/亚叶酸钙化疗的晚期结直肠癌患者血浆UH2与U峰面积，计算所得UH2/U值范围为0.07～3.12。该比值与相应5-FU血浆半衰期呈负指数相关，与患者5-FU毒性相关。Serdar等采用LC-MS/MS测定45例接受5-FU治疗患者PBMCs中5-FUH2和5-FU浓度，计算得5-FUH2/5-FU值为21.9±3.72，2例DPD缺失患者分别为1.26和1.61，说明DPD活性缺失可使5-FU的清除率严重降低。 Van Kuilenburg AB等以放射性[4-14C]THY为底物，采用反相高效液相色谱方法检测THY及其降解产物THY2浓度，以每毫克蛋白每小时代谢生成的THY2 nmol数表示DPD活性。结果显示，2例5-FU治疗出现严重毒性反应的癌症患者PBMCs DPD活性分别为3.2nmol·mg-1·h-1和4.2nmol·mg-1·h-1，低于健康志愿者平均DPD活性水平。其中1例患者治疗后康复期DPD活性恢复到正常水平（8.6nmol·mg-1·h-1）。进一步研究显示，44例接受5-FU/亚叶酸钙化疗患者PBMCs中DPD活性在4.2～16.0nmol·mg-1·h-1范围内呈高斯分布，较低DPD活性与中性粒细胞减少症显著相关，但与胃肠道反应、流感样症状、手足综合征等毒副反应无相关性。 Büchel等采用LC-MS/MS方法测定10例结直肠癌患者接受5-FU治疗前内源性血浆U、UH2及接受5-FU治疗2h后外源性5-FU、5-FUH2浓度。结果显示，U和UH2浓度范围分别为（0.07～2.6）和（0.81～1.77）μM，UH2/U值为3.7