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基因工程使用CRISPR-Cas9 system 目标核酸酶是强大的工具对于高精度调节基因组。来自微生物适应性免疫系统(crispr)的指导RNA cas9核酸酶可以被用来促进高效的真核细胞基因组工程，通过在其指导rna内指定一个20-nt目标序列。在这里,我们 描述一组用来基因组编辑工具cas9-mediated，通过(NHEJ)或(HDR)在哺乳动物细胞中,以及下游功能研究代转基因细胞系。为了减少非目标分裂,我们进一步描述double-nicking策略使用用配对的指导rna的cas9 nickase突变。这个协议提供了实验结果为指导的目标选择,分裂效率的评价和分析非目标活动。目标设计、基因修改可以在短短1-2周实现,修改克隆细胞株2-3周内可生成。 introduction 控制生物系统能力,在基础科学生物、药学和生物技术拥有巨大的应用潜力。可编程具体序列核酸酶、促进内源性基因位点的精确编辑现在可以实现系统基因组功能的讯问和在广泛的物种基因变异,包括那些以前没有基因易处理的。最近几年出现了大量的基因组编辑技术,包括(ZFNs),(Talens)和crispr。前两种技术使用了限制核酸内切酶催化域来模块化DNA结合蛋白质的策略包括诱导DNA双链断裂(DSB)。相比之下,Cas9是小rna引导下的核酸酶,通过与沃森克里克目标DNA碱基配对,代表系统明显更容易设计,非常具体、高效、很好的高产适应度和对于多种类型的细胞和生物体有多路复用基因编辑。 使用工程核酸酶的基因组精确编辑 和ZFNs和talens很像,Cas9通过刺激在目标基因位点DSB促进基因组编辑。通常根据Cas9分裂,目标位点进行DNA损伤修复的两个主要途径之一(图2):容易出错NHEJ或高保真HDR途径,两者都可以用来实现所需的编辑结果。缺乏修复模板情况下，DSB通过NHEJ 重新捆绑,使缺口发生插入/删除(indel)的突变。NHEJ可以被用来调节基因淘汰,indels发生在编码外显子会导致移码突变和过早地停止密码子。多个DSB另外可以用来调解更大的基因组中删除。 HDR是另一个主要的DNA修复途径。尽管HDR通常发生在比NHEJ更低, 频率更多样的情况下，它可用于在外在的引入修复模板存在的情况下在目标位点生成精确明确修改。修复模板的形式可以是使用同源臂侧面插入序列的传统双链DNA目标结构,或单链DNA寡核苷酸(ssODNs)。后者提供了一种有效而简单的方法使小编辑基因组中,如探索随机的基因变异的单核苷酸突变。与NHEJ不一样,HDR通常只在细胞分裂活跃,和它的效率差别很大取决于细胞类型和状态,以及基因位点和修复模板。 Cas9: 对于基因组编辑的RNA引导核苷酸 Crispr-cas是用RNA引导核苷酸来分开外来基因元素的微生物适应性免疫系统。三种类型(1-3)CRISPR系统已经被确认在广泛的宿主细菌和古细菌存在,其中每个系统由一群CRISPR-associated(Cas)基因,非编码rna和一系列独特的重复元素(直接重复)。这些重复被隔开通过短的多样的来自外源DNA序列目标（称为protospacers）,和他们一起构成了CRISPR RNA(crRNA)排列。在DNA目标内,每个protospacer总是与protospacer adjacent motif (PAM)相连，可多样化依赖于特定的CRISPR系统。 II型CRISPR系统是一个最好的特点的、,由核酸酶Cas9,crRNA排列编码指导rna和必需的、辅助的、促进crRNA排列变成离散单元的进程的trans-activating crRNA(tracrRNA)。然后每个crRNA单元包含一个20-nt指导序列和部分直接重复,前者指导Cas9 变成20-bp DNA目标通过沃森克里克配对 (图1)。在来自酿脓链球菌和CRISPR-Cas system中， (该协议中使用的系统),目标 DNA必须立即先于5-NGG PAM， 图1 |示意图的RNA-guided Cas9核酸酶。从化脓性链球菌(黄色)Cas9核酸酶是针对基因组DNA(例如人类EMX1)通过一个20-nt序列(蓝色)和支架(红色)sgRNA。(蓝色栏上链)直接上游的5-NGG(PAM,粉色)DNA目标。Cas9上游的PAM(红色三角形)。协调~ 3bp。 而其他Cas9直接同源可能有不同的PAM需求,如S. thermophilus (5-NNAGAA CRISPR1和5-NGGNG CRISPR3)和脑膜炎(5-NNNNGATT)。CRISPR-Cas的RNA引导的核酸酶的作用是人类密码子Cas9和必要的RNA在哺乳动物细胞。此外,crRNA和tracrRNA融合在一起来创建一个嵌合, RNA(sgRNA)(图1)。