第3章基因操作的基本技术教案.ppt

* 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计.重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。 * * 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay） * CT:指数期的循环次数 * * GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶） * 内标CT值的差别是不同反应管之间 扩增效率的不同造成的。 重叠延伸PCR原理 A1 A2 B1 B2 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ A1 B2 A1 B2 (3)反向PCR 反向PCR是用于扩增、克隆已知DNA区段上下游旁侧区段的PCR方法，可以用于确定未知的旁侧DNA序列。 原理图： 如果已知序列为转座子，可以高通量的进行基因型-表型关系的鉴定和研究 ★ （4）多重PCR 多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同 多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定, 或者病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。 在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染 在疾病诊断方面可以节省大量时间和病人DNA样品 ★ （5）不对称PCR（asymmetric PCR） 不对称PCR：用不等量的引物对扩增产生大量单链DNA的PCR方法,用于DNA测序和探针制备 两条引物的比例50:1~100:1， 先产生双链DNA，量少的引物耗完后开始产生单链DNA，PCR结束后通过电泳分离单、双链DNA，回收单链DNA ★ （6）嵌套PCR（nested primer PCR） 嵌套PCR：是指用两对引物扩增一个目标片段的PCR，第一对引物序列在第二对引物序列的外侧（外引物和内引物）。 如果内侧引物的特异性比较差，使用该引物不能使靶序列得到有效扩增。这时可以先用特异性好的外侧引物进行PCR，然后将其扩增产物作为模板，用内侧引物进行第二次PCR。 反之，如果外侧引物特异性较差，通过内侧引物再次PCR也能提高特异性（两对引物均可扩增同一条非特异性条带的可能性很小） 半嵌套PCR：三条引物，其中一条同时充当外引物和内引物。 ★ （7）热启动PCR（hot start PCR） 热启动PCR: 温度 超过70℃才能进行DNA聚合反应的PCR。 一般Taq DNA聚合酶在低温条件下也有活性，如果引物特异性差，当PCR反应体系配置完成之后，如果模板中有部分单链，有可能部分引物在错误位点结合进行非特异性扩增。 模板预热法（70 ℃后加入引物和酶等物质） 蜡防护层法 改进的耐热DNA聚合酶（94 ℃高温处理后才具有活性） ★ （8）免疫PCR（immuno PCR） 免疫PCR：是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来，利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶反应来放大抗原抗体结合率的一种改良型ELISA。 抗原 亲和素 标记的抗体 + + DNA 报告分子 生物素 PCR 检测 ★ 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay） 降落PCR ：是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低,从而达到最佳扩增条件的PCR方法。 反应过程中起始退火温度高于Tm 值,随着循环的进行,退火温度逐渐降低到Tm 值,从而确保第一个引物- 模板杂交事件发生在最互补的反应物之间,退火温度最终低于Tm 值。 退火温度的范围可跨越15 ℃,从高于Tm 5 ℃至低于Tm 10 ℃左右,条件允许的话,退火温度可以1 ℃~ 2 ℃递降。尽管退火温度最终会降低到非特异性杂交的Tm 值,但此时目的扩增产物已开始几何扩增,在剩余循环中将超过任何非特异性产物的扩增量。 降落PCR 是一种潜在的一步法找到最佳退火温度的