园艺植物生物技术第二章园艺植物脱毒题库.ppt

第二章 园艺植物脱毒与离体快速繁殖 第一节 园艺植物病毒病的危害 汁液摩擦接种法：从被鉴定植物上取1~3g幼叶 →研碎→过滤→取滤液涂抹于指示植物的叶面上（金刚砂）→保温15~25℃ →接种后2~6d 可见症状出现 。 第二节 园艺植物的离体快速繁殖 离体快速繁殖的意义 离体快速繁殖的方法 * * * * * * * 4.热处理结合茎尖培养或微嫁接技术脱毒 将热处理与茎尖分生组织培养结合起来，则可以取稍大的茎尖进行培养，这样能够大大提高茎尖的成活率和脱毒率。 5.抗病毒药剂脱毒 在茎尖培养和原生质体培养中，在培养基内加用抗病毒醚(ribavirin)，能抑制病毒复制。 山家弘士 (1986)发现抗病毒醚对苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV) 和苹果茎沟病毒 (ASGV)，在苹果植株体内都有抑制增殖效果。 目前用此法也不可 能脱除所有病毒，如果使用不当，药害现象比较严重， 此种脱毒处理还处于探索阶段。 五 脱毒苗的鉴定及检测技术 脱毒效果的检测 1、形态检测法 脱毒苗叶色浓绿，均匀一致，长势好 2、指示植物法 指示植物法是利用病毒在其他植物上产生的枯斑和某些病理症状，作为鉴别病毒及病毒种类的标准，也叫枯斑或空斑测定法。 接种某种病毒后能快速表现特有症状的植物称为指示植物（indicator plant），又称鉴别寄主。 2、接种方法 汁液摩擦接种法 嫁接法：小叶嫁接法 双重芽嫁接法 双重切接法 指示植物直接嫁接法 血清学鉴定 植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白(抗原 antigen)， 给动物注射后会产生一种相应的免疫球蛋白，称为抗体（antibody） 抗体是动物在外来抗原的剌激下产生的一种免疫球蛋白，抗体主要存在于血清中，故含有抗体的血清即称为抗血清 (antiserum) 。 这种抗原和抗体所引起的凝集或沉淀反应就叫做血清反应。 因此，利用已知的抗体与未知的抗原能否特异结合形成抗原-抗体复合物（血清学反应）的情况可以判断病毒的有无。 常用血清学鉴定方法 （1）免疫电镜技术 （2）酶联免疫吸附分析 （3）直接组织免疫杂交分析 抗原吸附 免疫修饰（加入抗体） 反应（染色，酶促反应） 洗脱 观察 电子显微镜鉴定法 现代电子显微镜 (electron microscope) 的分辨能力可 达 0.5nm， 因此利用电子显微镜观察， 比生物学鉴定更直观，而且速度更快。 对不表现可见症状的潜伏病毒来说，血清法和电镜法则是惟一可行的鉴定方法 。 能否观察到病毒，还取决于病毒浓度的高低， 浓度低则不易观察到。 分子生物学检测法 核酸杂交技术（人工标记的病原互补DNA，杂交，显影） PCR技术 双链核糖核酸分析 病毒复制时以单链RNA为模板合成双链RNA，一般不易被降解。所以一旦植物感染病毒，体内就会存在双链RNA。所以提取待检测样本的总RNA，将DNA和单链RNA降解后，凝胶电泳分析样品中是否有双链RNA 脱毒苗的保存与繁殖 原原种：脱毒试管苗出瓶移栽后的苗木被称作原原种 (initail stocks)，一般多在科研单位的隔离网室内保存 。脱毒原原种苗每年应进行一次病毒检测，发现问题即淘汰。检测机构要将病毒检测结果报告有关部门。 原种：脱毒原原种苗定植于无土壤线虫、无病源和防虫隔离区内，分株繁殖的第一代植株为脱毒原种苗 由脱毒原种苗定植于无土壤线虫、无病源和防虫隔离区内，分株繁殖后代为脱毒生产用苗。 脱毒苗的保存 离体保存 防虫纱网棚室 隔离区种植 脱毒苗的繁殖 继代培养 愈伤组织：繁殖最快，繁殖后代遗传性不稳定 不定芽：繁殖较快，但有嵌合体的形成 丛生芽 生根及微型鳞茎的培养 隔离区种植 离体快速繁殖（rapid propagation in vitro），是指通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在人工控制的营养和环境条件下进行培养，使其在较短的时间内快速地再生出大量的完整植株的方法。 第一阶段: 建立无菌培养体系 主要是为了获得无菌外植体，控制达到无菌条件，以利于植物材料生长，获得愈伤组织或器官，这是整个培养中至关重要的一步。 第二阶段: 增殖 不断分化产生新植株或直接产生不定芽及胚状体，也可根据需要不断反复地进行继代培养，以达到大量繁殖的目的。 第三阶段:生根培养 将获得的无根试管苗可转移到生根培养基上进行生根培养，也可直接切取进行扦插生根，并逐渐进行锻炼，增加光照强度，培养植株的耐旱性和抗病性，以提高植株移栽的适应能力。 第四阶段: 试管苗