质粒DNA的提取定量与酶切鉴定.docVIP

一、实验目的实验原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。 ①延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链； ②变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链； ③退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 2. 质粒DNA的提取与定量——碱裂解法： A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； B、高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性； C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。 D、定量检测原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应； 而且物质对光的吸收是具有选择性的； 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 3.酶切鉴定：利用限制性内切酶。 4、琼脂糖凝胶电泳： A、琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度； B、DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动； C、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。 三、材料与方法 试剂 体积(μl) 无菌水 10*M酶切缓冲液Buf R 质粒DNA Hind III (15U/ul) EcoR I (12U/ul) 9.0 2.0 7.0 1.0 1.0 用移液枪轻轻混匀(避免产生气泡)，37℃水浴1.5h 4、琼脂糖凝胶电泳： 凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上样→电泳→取出凝胶→拍照 四、结果与讨论.6A260/A2801.8，说明样品中仍含有蛋白质或者酚,但结果仍在正常范围之内，说明该数值可用于接下来的计算。 2、根据电泳结果显示：质粒呈3个条带，PCR产物是1个条带。条带较其他结果较模糊，说明所提取的质粒DNA浓度较低。根据DNA Marker 泳道，可知所提取的质粒DNA大小约为3000bp，是较为准确的。 思考题： 1、碱法提质粒中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的作用？ 答：溶液Ⅰ的作用是溶菌。溶液中含有溶菌酶、EDTA，溶菌酶能溶解细菌的肽聚糖细胞壁，因而具有溶菌作用。EDTA可以螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用，同时EDTA还可以加强溶菌酶的溶菌效果。 溶液Ⅱ的主要作用是：提高碱环境，使染色体DNA和质粒DNA变性；溶液中的SDS可以溶解细胞膜，解聚核蛋白并且结合蛋白质形成复合物使蛋白质沉淀下来。 溶液Ⅲ起缓冲液的作用，调节Ph至中性使质粒DNA复性；溶液还提供了高盐环境，有利于大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物沉淀下来。 2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 答：严格执行操作步骤，避免残留太多杂质；提取质粒DNA时使乙醇尽量挥发干净，以免影响限制酶的活性。 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。 往培养物中加入250μl 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20℃保存备用。 加入350μl 溶液S3，立即温和混匀6~8次。13000rpm离心10min，小心取上清液（500-800μl ）。 空柱13000rpm离心1min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发。 加入250μl 溶液S2，颠倒4～6次混匀，直到溶液变得清亮。 向吸附柱中加入700μl 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液。 加入500μl去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液 用紫外分光光度计进行定量检测。 质粒 PCR目的条带 100 250 500 750 1000 1500 2000 3000 5000