优质课DNA的粗提取与鉴定解析.ppt

⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 获得含核物质的滤液 ⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液 获取纱布上的DNA粘稠物 ⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液 得到含DNA的滤液 第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液 加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA 第二次搅拌加2mol/LNaCl溶液的滤液 目的是使DNA充分溶解在2mol/LNaCl溶液中 第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/LNaCl溶液 稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物 第四次搅拌放入2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物 使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中 第五次搅拌体积分数为95%的酒精 * 一、基础知识 （一）提取DNA的方法 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子 2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取） 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 ⑴ DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 利用这一特点， 选择适当的盐浓度 就能使DNA充分溶解， 而使杂质沉淀； 或者让其他成分溶解， DNA析出 3.DNA等大分子的理化性质 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 4、DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反 ①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？ 在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。 ②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？ 当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出 DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质， 对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性 ③ 洗涤剂——瓦解细胞膜， 但对DNA没有影响 试剂： （二）DNA的鉴定 条件： 二苯胺 沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色 沸水浴 现象： （一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定 二、实验设计 （一）实验材料的选取 从下列材料中选取2～3种 原则： 菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜； 鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞； 在液体培养基中培养的大肠杆菌 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑 但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大 材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固） 思考题：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？ 不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核 动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。 讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 2、植物细胞 ①植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜 ②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液 讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解 讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等 思考：加入蒸馏水的目的是什么？ 加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA 思考题：搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不