PCR基本知识.docVIP

PCR 一. PCR 1. 原理 技术原理 DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 工作原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。磷酸统称变量作用dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。双链板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处