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将载体和目的基因同时用两种酶切割，然后将外源基因插入载体中去，通过选择性标记来确定插入是否成功。 优点：保证了目的基因的定向插入。 缺点：同样存在载体的自身环化问题。 重组率 重组率＝含有外源DNA的重组分子数／载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25％－75％ 连接子导入受体细胞 转化 (Transformation )Certain prokaryotes are able to take up free DNA released by other bacteria. This process is called transformation . 将质粒或DNA导入宿主细胞，引起细胞遗传的改变。 　 真核细胞的转化。 原核生物中，偶尔也用到 transfection 这个词，当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是病毒DNA时就应该称此过程为转染。 转染（Transfection） 转导（Transduction） Transfer of host DNA from one cell to another by a virus. 通过噬菌体(或病毒)将宿主基因从一个细胞转移到另一个不同基因型的细胞中。 常用的方法 CaCl2感受态法 噬菌体体外包装法 电穿孔法 DNA-磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 病毒感染法 基因枪法、病毒载体 原核细胞 真核细胞 基因治疗 插入失活法 α - 互补现象 酶切鉴定、电泳鉴定 PCR 表达产物鉴定 杂交鉴定 DNA测序 表型筛选法： 其它方法： 2、兰-白斑筛选 LacZ基因，该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色 ?-半乳糖苷酶 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 蓝白班筛选 培养皿准备：抗生素、IPTG、X-gal 涂上转化的工程菌 孵箱中培养8-12h ?-互补 ?-互补现象是表型筛选的一个重要手段。 将缺陷?-半乳糖苷酶N端部分序列的质粒载体转入缺陷?-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主菌，并且在含有X-gal的培养基上选择性培养，用乳糖类似物IPTG作为安慰性诱导剂进行诱导。质粒转入宿主菌后，宿主与质粒产生的有缺陷的?-半乳糖苷酶之间可以形成互补，对X-gal进行降解可产生蓝色菌落，这就是?-互补现象。 一、双脱氧链终止法 二、化学降解法 基因测序 Sanger双脱氧链终止法原理 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。并以此推导出模板链的DNA序列。 一、Sanger双脱氧链终止法： 由Sanger于1977年发明； 与 PCR反应类似； 反应体系： 模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性－复性－延伸－终止 DNA测序结果分析 读取合成链的核苷酸序列时，应从下往上读取。?? 而模板链则应该从上向下读取，并且转换为测序的核苷酸的互补的核苷酸。 二、 化学降解法 测序原理 * * * * * * * * 生化药学教研室制作  基因工程基本过程与方法 一、目的基因的获取 （化学合成法、PCR法、基因文库法） 二、用于基因克隆的载体 三、载体与目的基因的连接 （单酶切插入、双酶切定向插入、同聚加尾法、人工接头法、T-A克隆法） 四、连接子导入受体细胞 （CaCl2感受态法、噬菌体体外包装法、电穿孔法、脂质体介导法、病毒感染法） 五、重组体克隆的筛选与鉴定 （抗性标记筛选、兰-白斑筛选、 DNA测序、电泳检测） 基因工程要素 外源DNA 载体分子 工具酶 受体细胞 分、切、接、转、筛 化学合成 聚合酶链反应 基因文库 DNA序列分析 核酸凝胶电泳 　　 核酸分子杂交 载体的构建 基因工程常用酶 转化转染技术 阳性克隆的筛选与鉴定 定点突变 * 化学合成法 * PCR扩增法 * 基因文库法 目的基因的获取方法 寡核苷酸片段的化学合成方法 化学方法合成DNA片段是一种十分成熟和简便的技术，利用DNA合成仪，根据待合成DNA片段预定的核苷酸序列，可自动地将4种