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基因克隆技术的诞生 ，发展 以及应用 基因克隆的方法，如何操作 Ⅲ 基因克隆的技术路线 选择载体： 不同需要选用不同载体 质粒（Plasmid） : 分子较小，操作简单，容量小，适合单个基因克隆。 克隆质粒 表达质粒：含表达调控元件 同源粘端连接 平端连接 定向克隆 优点：连接效率高 1.可连接任两平端切口 1.连接效率高 2.可恢复甚至产生新切点 2.定向克隆 3.防止自身环化 缺点：1.载体自身环化 1.载体自身环化 目的基因须有与 2.双向克隆 2.双向克隆 载体两端互补的 3.多copy插入 3.多copy插入 粘端切口 连接：低温、低酶 高温、高酶 、低ATP 低温、低酶 高ATP 高低物浓度 高ATP 四支不同的反应管 G管： 分别在不同的鸟嘌呤处的磷酸二酯键断裂 A+G管：除了在不同的鸟嘌呤处的磷酸二酯键断裂外，还包含在腺嘌呤处磷酸二酯键断裂的片段 T+C管：同上类似，含有在胸腺嘧啶和胞嘧啶断裂的片段 C管：含有胞嘧啶断裂的片段 思考题 　 　1.简述已 知 基 因及未 知 基 因克 隆 策 略？ 　　 2.试述筛选重组子的方法有哪些？ 3）蓝白斑筛选（?一互补） 载体：LacZ的调控序列和N端146个氨基酸残基的编码序列（?受体） 宿主菌：染色体DNA含有LacZ的C 端编码序列  （?供体）  ?一互补 分解生色底物X-ga1（5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷）产生蓝色外源DNA片段插入质粒的多克隆位点  白色克隆 2．按插入基因的遗传性状进行筛选 （外源基因表达产物鉴定法） 抗体检测（Western Blot) 蛋白质生物功能检测法 蛋白凝胶电泳检测法 （二）根据重组子的结构特征筛选 1．快速裂解菌落鉴定分子大小 重组子的分子量较大（适用于插入片段较大的重组子） 2．内切酶图谱鉴定 重组子与非重组子的内切酶图谱不同 3．PCR筛选重组子 利用插入片段两端的特异引物，进行PCR，能扩增出特异片段的转化子为重组子。 1 2 3 M 1 2 3 M 1 2 3 未酶切质粒；2. EcoRI 单酶切；3. EcoR1+Hind Ⅲ双酶切 M. DNA Marker. 4.原位杂交 目 录 五、目的基因的确认分析——DNA序列测定1、Maxam-Gilbert化学降解法测定pBR322 4362 bp的序列， 2、DNA双脱氧末端终止法测序 变性 单链 DNA 双链 DNA G A+G T+C C 破坏特定碱基 DNA链末端合成终止法 G A T C 测序反应 电泳 AACGTGGACT AACGTGGAC AACGTGGA AACGTGG AACGTG AACGT AACG AAC AA A 5 3 正极 负极 ddG ddA ddT ddC 链末端合成终止法测定DNA序列的原理 未 知 基 因 克 隆 策 略 一、基因文库的构建 基因组文库 来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。 cDNA文库 来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态