CDC25B在K562红系原始细胞分化111-2资料.ppt

LOGO CDC25B在K562红系原始细胞分化过程中的作用 内容 红细胞的生成经历的骨髓多功能干细胞向红系的分化决定以及红系祖细胞的继续分化和发育成熟。这一过程涉及多个基因有序开启和关闭的复杂而又紧密的调控。 小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的重要调节分子，迄今共发现了500多种人类miRNAs,估计约有30%的人类基因被miRNAs调节。目前认为成熟的miRNA沉默目的基因的作用机制与siRNA的作用机制相似，二者最终均形成蛋白复合物RISC(RNA一 induced Silencing ComPlex)通过在mRNA水平剪切目的基因或抑制目的基因翻译两种方式来抑制目的基因的表达，在哺乳动物以后者为主。 K562细胞系是红白血病细胞系，处于多能髓样祖细胞阶段而停止继续分化。在氯高铁血红素(hemin)诱导下可继续红系分化过程，在佛波脂 (PMA)的诱导下可以向巨核系分化。 实验一 将K562细胞铺板于6孔板。在0t,3t,6t,12t,24t,48t的时间点分别加入30nMhermin诱导k562细胞后观察结果。结果如图1。实验证明了用hermin（30nM)处理K562细胞后，mir27-a的相对表达量0-24t表达成阶段性上升，在48t时开始下降。说明Mir27-a在红系分化中有一定作用。 0 1 2 3 4 0 3 6 12 24 48 h Hermin(30nM) Mir-27a relative expression 用Hermin诱导k562细胞后Mir27-a不同时间点的相对表达量 实验二 双荧光蛋白报告基因分析系统是一种验证微小RNA 靶基因的可靠方法。所以我们用此系统证明CDC25B是mir27-a的靶基因。将CDC25B的3’UTR区可能与miRNA作用的位点克隆到荧光 报告基因的下游，与mir27-a共同转染K562细胞后，观察过表达mir27-a对荧光酶素表达的影响。 结果发现过表达mir27-a能够使CDC25B 3’UTR区的报告质粒荧光霉素表达量降低，说明mir27-a能抑制CDC25B的表达，CDC25B可能是mir27-a的靶基因。 实验三 Hermin（30nM）诱导K562细胞后Westen blot检测了CDC25B蛋白表达量的变化，比较图一，当诱导K562细胞后mir27-a的相对表达量是阶段性升高的，而mir27-a对CDC25B有抑制作用，所以CDC25B的蛋白表达量在24t时最低，用westen blot 也证实了在mir27-a表达增高时CDC25B蛋白的表达下降，说明CDC25B是mir27-a的靶基因。 CDC25B GAPDH Hermin(30nM) 0 3 6 12 24 48 h hermin诱导K562细胞后CDC25B的蛋白表达量 miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。我们将K562细胞铺于6孔板后，转染了mimics 、nc mimics 、inhibior 、inhibior nc48小时后收细胞提取RNA后做westen blot，过表达mir27-a后CDC25B的蛋白相对表达量降低，而抑制mir27-a后CDC25B的蛋白表达量升高.CDC25B对红系分化是否有影响呢？我们就要做接下来的实验。 CDC25B GAPDH NC Mimics Ihinbior-NC Ihinbior 0 0.5 1 1.5 2 2.5 NC Mimics Inhibitor-NC CDC25B mRNA relative expression CDC25B mRNA的相对表达量 CDC25B GAPDH siRNA Control 转染CDC25B siRNA后蛋白表达量 接下来要做的实验： 1. 上次转染CDC25B siRNA后做WB后不理想。所以转CDC25B siRNA的浓度需要摸索；摸索出转染siRNA的浓度后做定量PCR检测r-Globin的表达与联苯胺染色实验。 2. A、用hermin（30nM）诱导K562细胞红系分化，诱导48小时后应用联苯胺染色，观察结果。 B、参照A的条件，转染mir27-a、 mimics、mimics nc后加hermin诱导48小时候收细胞提取RNA后逆转录为CDNA，检测r-globin的表达。