3.4_NA_Hyb_seqN2详解.ppt

1. 方法 1 酶法:双脱氧核苷酸链终止法 dideoxy-termination sequencing 原理:双脱氧 2‘,3’ -核苷酸可以象2‘-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中,但因3’ 端不具OH基,DNA链合成至此中断. 由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同, 故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列. 一. DNA的核苷酸序列分析 * 过程：制备ssDNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。` 该法亦适合mRNA的序列分析。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。 * 原理: DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应,然后发生碱基脱落或取代，最后发生链断裂,不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列. 2 化学法 * * i. 嘌呤 A和G 序列测定 硫酸二甲酯处理DNA链时,G的7位和A的3位氮原子被甲基化,甲基化后的嘌呤环可被哌啶取代,从而导致链断裂.由于G比A 更易甲基化 5倍 ,且mG比mA更不稳定,因而易发生链断裂. 控制好反应温度与时间,只使G反应而A不反应,从而可测出G序列. 若用甲酯代替硫酸二甲酯,A与G均会发生反应.比较两反应系统电泳结果,就可知道A的序列. ii. 嘧啶（C和T）序列的测定 用肼处理ss-DNA时,可使嘧啶开环,被哌啶取代后而导致磷酸二酯键断裂.若反应在高盐浓度下进行,T与肼的反应受抑制,因而可测得C的序列,比较加盐与不加盐反应的结果,就可测定T的序列。 该法的优点是不需要模板,引物和DNA聚合酶.待测DNA链的检测用32p末端标记 化学测序结果示意图 * 酶法测序 Sanger 化学测序法 Maxam-Gilbert 待测DNA片段 待测DNA片段 ↓ ↓ 次克隆 5’-末端标记 ↓ 筛选重组子 链分离 限制酶切 ↓ 模板增殖与纯化 ↓ ↓ 纯化标记的ss-DNA 与引物退火 ↓ ↓ 定序反应 定序反应 ↓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 真空干燥 ↓ 放射自显影 ↓ 阅读序列和计算机录入 ↓ 核苷酸序列的分析与比较 2. DNA定序的一般程序 * 3. 两种定序方法的比较 1 化学法 i. 优点: 所有片段具有相同的标记强度；一次可以读出250-400个核苷酸；定序分析不需要次克隆；不受二级结构区的影响；多A区定序清楚；适合500bp或以下DNA片段的定序分析。 ii. 缺点: 需限制酶图；需放射自显影时间较长和增感屏；DNA片段需经凝胶纯化； 多嘧啶区定序不够清楚；所用试剂为诱变剂和致癌物质。 2 酶法 i.优点: 反应简单，易于操作；具有配套载体和宿主菌；不一定需要详尽的限制酶图；可采用多种方法进行次克隆。 ii.缺点: DNA带放射强度不均匀；下游碱基阅读困难；需要大量的次克隆和鉴定工作；二级结构区和多C区定序困难。 定序方法的选择主要依据所需测序DNA长度，实验目的等。 * 1. 单链定序系统 1）M13mp 系列载体定序系统 i. 从细胞中获得dsDNA,以利待测DNA片段的重组,经转化进入细胞； ii. 从培养液中获得病毒颗粒, 提取ss-DNA用于测序,病毒经感染将 ssDNA引入细胞； iii. 含有β-半乳糖甘酶α-链基因,易于重组子检测; iv. 多克隆位点区有利于外源DNA插入,因配套载体的多克隆位点区方 向相反,有利于待测DNA端靠近载体上的引物变性区; v. 各种引物易于获得; vi.有与载体配套的各种宿主菌, 如 E.coliJM系列,DH5αF’ 等。 2 噬粒载体定序系统 该系统具上述M13mp系统的特点外,它容纳的外源DNA片段较长;直 接在同一重组分子进行各种次克隆;操作较简单;同时亦可用于双链定序. 与M13mp系统相比较，噬粒载体系统有以下两缺点： i. 形成单链时需辅助噬菌体，它亦可形成病毒颗粒； ii. 制备ss-DNA时需较多培养液,而M13mp系列载体仅需1.5ml培养液 二. 酶法定序系统 * 任何一种质粒载体质粒载体均可用于此目的，只要有适合的引物。该系统的一个最大优点是操作简单，可进行双向定序，大大减少次克隆工作量。 与单链定序系统相比较，该系统每次可阅读序列较少，反应中其他干扰较多。 2. 双链定序系统 * * 3. 基于PCR反应的酶法测序 1）引物 正向引物与反向引物：凡是含有LacZα基因失活的标记基因的各种载体,与多克隆位点区下游某序列可复性的引物称为正向引物 forward primer ,反之,位于多克隆位