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逆转录PCR 概念 　　逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 　　由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 　　RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法） 　　RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 PCR技术相关试剂 　　 　　A液：变性液 　　B液：醋酸钠溶液 　　C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1） 　　D液：异丙醇 　　E液：75％乙醇 　　F液：DEPC处理的灭菌去离子水 　　G液：RNA酶抑制剂 　　H液：反转录反应液 　　I液：反转录酶 　　J液：PCR反应液 　　K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／micro;l) 　　L液：矿物油 　　M液：50倍TAE电泳缓冲液 　　N液：溴化乙锭溶液 　　0液：上样缓冲液 PCR各步骤的目的 　　（一）预变性： 　　破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。 使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 　　（二）变性--退火--延伸循环： 　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 　　（三）用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 　　1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 　　2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。1．缓冲液标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl ， pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2 ，有时使用 Mn2 。一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。 Mg2 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G C 模板的扩增效率。 2．脱氧核苷三磷酸（dNTP）脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。 dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。 3．引物在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml ， 在 100 μl 反应体系中相当于个分子。如果 5% 用于扩增 1kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 μg 的产物，足以用于常规分析。 引物设计一般要考虑以下几个问题：① 长度：至少 16bp ，通常为