第十七章 基因重组与基因工程 (genetic recombination and ....pptVIP

第十七章 基因重组与基因工程 genetic recombination and genetic engineering 基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。 基因克隆 将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。 基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。 本章主要内容 重要的工具酶 基因克隆常用的载体 重组DNA基本原理 重组技术在医学和制药 工业中的应用 第一节 重要的工具酶 工具酶 基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。 ⑴ 产生5-粘性末端 ⑶ 产生平 头末 端/钝端 同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。 在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。 同裂酶——同识同切 同裂酶——同识异切 同 尾 酶 同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。 可变酶 可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的， 并且识别顺序往往超过6个碱基对。 如， BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。 常用限制性核酸内切酶的特性 二、DNA聚合酶 （最常用的DNA聚合酶有以下4种） DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌体DNA聚合酶 ㈠ DNA聚合酶Ⅰ E.Coli DNA聚合酶Ⅰ（DNA pol Ⅰ） 是一个具有 3 种酶活性的多功能性酶。 包括： 5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 DNA pol Ⅰ应用 ⑴ 催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA 探针； ⑵ 第二条cDNA链的合成； ⑶ 对DNA3’突出末端进行标记； ⑷ DNA序列分析。 E. coli DNA pol. Ⅰ催化切口平移 Klenow片段用途 ⑴ 补齐双链DNA的 3ˊ末端； ⑵ 用标记碱基补 齐3ˊ末端 ； ㈢ Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶） 作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 ? 75℃， 2） 95℃以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。 三、逆转录酶 特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性： ⑴ 以单链RNA 为模板， 催化合成cDNA单链 ⑵ 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA ⑶ 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。 逆转录酶的应用： ⑴ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； ⑵ 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段； ⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析； ⑷ 制备杂交探针等。 四、DNA连接酶 DNA ligase 五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶 BAP 能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。 用途 ⒈ 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。 ⒉ 用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。 六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶 TdT 重要的工具酶 第二节 基因克隆常用的载体 载体 vector 是将外源DNA 目的DNA 片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA 。 本节主要内容 载体必须具备的基本条件 载体的种类 常用的载体 一、载体必须具备的基本条件 ⒈ 有自身的复制子，能独立复制 ⒉ 具备多个限制酶的识别位点 多克隆位点 ⒊ 具有遗传表型或筛选标记 ⒋ 有足够的容量以容纳外源DNA片段。 ⒌ 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动 子、前导序列、增强子等调控元件。 ⒍ 载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。 二、载体的种类* （一） 克隆载体 用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性： ⑴ 能够在受体细胞复制； ⑵ 带有药物抗性基因，便于筛选； ⑶ 可导入受体细胞。 （二）表达载体 除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。 三、常用的载体 （一） 质粒 plasmid ： 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。 作为克隆载体的质