2.2_Ecoli_Vector学案.pptVIP

SacB基因:编码一种将蔗糖转化为果聚糖的酶，当含该基因的细胞培养在2%以上蔗糖培养基中时,果聚糖积累在细胞周质空间内,导致大肠杆菌细胞死亡. SacB基因被克隆到原Tetr 基因的BamHI- SalI间,在其上游加上E.coli基因启动子,克隆位点BamHI位于这两个DNA片段间,外源DNA片段插入时可进行显性筛选重组子 为了使sacB基因自发突变减小到最小限度,sacB基因上游还有一个P1 C1阻遏物结合位点与其启动子重叠.凡是表达P1 C1基因的细胞,sacB基因表达受阻,在无蔗糖条件下,这种细胞会生长得更好 iii. 克隆策略 3.3 kb短臂：含pac,loxP, 无启动子的sacB 26 kb长臂: 含P1裂解复制子,Kanr,P1质粒复制子,loxP 位点. * 包装: 重组DNA分子先用pacase或抽提物Ⅰ酶切pac位点,然后用抽提物Ⅱ(含头部和尾部)进行包装直至头部充满DNA,最后与尾部相连成有感染力的重组P1噬菌体颗粒. iV.??重组DNA分子形成 当重组DNA分子进入宿主细胞后,特异性位点重组发生在两个方向相同的loxP位点, 该过程由宿主细胞表达的重组酶(Cre)催化. v. 宿主菌 E.coli NS3529菌株基因型recA-,lacIq,mcrABC,mrr:recA-:防止插入DNA片段内的同源重组,以免发生重排; lacIq: 抑制P1裂解复制子的激活,使P1质粒复制子在细胞中以单拷贝形式存在,亦防止外源DNA分子重排; mcr/mrr: 抑制富含GpMeC或ApMeC插入片段的选择性丢失 * 1)? 结构特征—环状ssDNA，病毒颗粒呈丝状 2)??复制过程: ss(+) ? RF(0-1 min) RF ? RF(0-20 min) RF ? ss(+)(20 min→∞) DNA包装无严格限制 3) 生活史 a.??病毒粒子靠小分子衣壳蛋白和A蛋白附着于性纤毛顶端(E.coli中 F因子提供) b. 病毒DNA和A 蛋白进入细胞内,大部分衣壳蛋白则留在细胞膜上 c. 病毒DNA变为双链复制形式(RF), 衣壳蛋白可能为DNA复制提供 附着位点 d.?RF进行滚环复制,形成单链,同时基因与蛋白质结合 e.?ssDNA环化,并形成线状的DNA—基因与蛋白质复合物 f.?病毒DNA穿膜时,基因与蛋白质被附着于膜上的衣壳蛋白取代, 完整病毒从细胞中释放,释放时不杀死细胞,但因感染细胞生长缓慢, 仍然 可见噬菌斑 3. M13和fd载体 * M13噬菌体的生活史 * 1) 基因结构 基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ编码特异性蛋白质,参与病毒颗粒的组装 基因Ⅱ参与DNA复制 基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ编码M13的结构蛋白 基因Ⅴ参与单链复制过程中的环化作用 基因Ⅵ是衣壳蛋白的重要组成部分 2) M13mp系列载体 a.?特点：在IR区中插入一个lacZα基因,然后在该基因中逐渐构建一个多克隆位点区,ds-DNA可用常规方法直接导入,ss-DNA常用感染的方法. 噬菌斑的形成用于选择DNA导入的细胞,在X-Gal平板上形成的无色噬菌斑检测重组子 b.?优点：易于获得ss-DNA用于DNA序列测定和基因突变,从细胞中易于检测分离到RF型的ds-DNA用于外源DNA重组M13mp系列载体的多克隆位点 * 噬菌体 M13 衍生的 载体 * 1. 结构特点:在普通质粒载体中插入一个或两个来自λ的cos位点片段, 双cos载体比单cos载体易于重组. l cos位点的精细结构 cos长200 bp, 由以下几个亚单位组成： a. cosN—由λ末端酶的gpA亚基识别和切割,产生5-12 nt突起； b. cosB—分别位于cosN的两侧,称之为cosBL(左侧)和cosBR(右侧),为蛋白质结合位点. R1、R2和R3长16 bp,其中有12个n.t相等,可与gpNul蛋白进行体外结合. R4与上述三个R片段仅有8个nt