原位PCR技术研究报告.ppt

⒈ 原位PCR扩增同直接法，但dNTP不需标记； ⒉ PCR扩增后进行原位杂交 （二）间接法原位PCR扩增 ⑴2×SSC杂交液配制Dig-标记特异性探针，探针浓度5ng/每片，20μl/每片，用前探针95℃变性10min； ⑵ 滴加探针，95℃ 5min，42℃温盒中杂交过夜； ⑶ 取掉盖玻片，4×SSC洗，室温2min； ⑷ 2×SSC、0.5×SSC、0.1×SSC，42℃洗各10min×2； ⑸ 加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体复合物，37℃，2h； ⑹ 碱性磷酸酶(NBT/BCIP)暗处显色； ⑺ 终止反应，封片观察。 （三）原位RT-PCR扩增 ⒈ 样本制备，蛋白酶消化均同直接法； ⒉ DNA酶处理（780u/ml浓度的不含RNA酶的DNA酶）可过夜。 ⒊ 反转录反应 表10-1 反转录和PCR反应液配方* ? 反转录反应液 PCR反应液 10×缓冲液 1× 1× MgCl2 5mol/L 4.5mmol/L 每一种dNTP 250μ mol/L 200μ mol/L 每一种引物 2μ mol/L 1μ mol/L Taq DNA聚合酶 － 8U/100μl BSA － 3μg/ml 甘油 － 10% AMV逆转录酶 0.4U/μl － RNA酶 2U/μl － 加水至 30μl 40μl