基因定点突变讲课.doc

基因定点突变 一、定点突变的目的把基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。引物设计引物设计的原则突变引物：25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，引物至少要11-12个才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个，并且合成多一条反向互补的引物。 30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。 （3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。 （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。 （5）最好使用经过纯化的引物。 ?????? Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。 四、引物设计实例 以GCG→ACG为例： 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’ （1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A