一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因-撰写11.22重点分析.doc

说 明 书 摘 要 一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因及其克隆方法，该方法包括步骤： (1)根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物 FAD6-F1(+)/FAD6-R1(-)，RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将核心片段克隆到载体上并测序；(2)根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’-和3’-RACE引物，FAD6-5’(-)和FAD6-3’(+)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将得到的该片段分别连接至载体后克隆并测序；(3)将5’和3’末端片段分别与获得的delta6去饱和酶基因核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序列。 摘 要 附 图 权 利 要 求 书 1. 一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。保守区序列引物 FAD6-F1(+)FAD6-R1(-)，RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将核心片段克隆到载体上并测序， FAD6-F1(+)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，FAD6-R1(-)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示； (2)根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’-和3’-RACE引物，FAD6-5’(-)和FAD6-3’(+)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将得到的该片段分别连接至载体后克隆并测序， FAD6-5’(-)的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，FAD6-3’(+)的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； (3)将5’和3’末端片段分别与所述核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序列。 4. 根据权利要求3所述的方法，其中步骤(1)和(2)中总RNA是从中华绒螯蟹肝胰腺中通过Trizol法提取得到的。 5. 根据权利要求3所述的方法，步骤(1)和(2)中所述载体是pGEM-T质粒 6. 一种载体，其包括权利要求1所述的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。 7. 一种转染细胞，其包括权利要求5所述的载体。 8. 一种转染细胞，其表达权利要求2所述的蛋白。 9. 根据权利要求7或8所述的转染细胞，其中所述细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或金斯瑞酵母 明 书 一种中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因及其克隆方法 技术领域 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因及其克隆方法。 背景技术 多不饱和脂肪酸(PUFA)是生物膜结构的重要组成部分，同时对人类的健康也具有重要作用，膳食中摄入的PUFA对心律失常有抑制作用，并且PUFA对心血管疾病的辅助治疗和预防也发挥了一定作用。此外，LC-PUFA与人体的健康更加密切相关，如二十二碳六烯酸DHA)可关系到胎儿的生长发育，某些LC-PUFA还可以降低炎症、癌症及心脑血管疾病的发病率等。脂肪酸去饱和酶Fatty acid desaturase，FAD)是生物体合成PUFA的关键酶，可催化饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酰基链上的双键的形成，使脂肪酸不饱和程度得以提高。是PUFA合成过程中的限速酶，能够催化饱和脂肪酸的第一步去饱和过程γ-亚油酸（GLA），以及催化α-亚麻酸（ALA）生成十八碳四烯酸（stearidnoic acid），它们是EPA及其后DHA生成的关键酶。目前研究已经从秀丽隐杆线虫、小鼠、斑马鱼虹鳟、军曹鱼、大西洋鲑鱼、鲈鱼、鲍鱼、金头鲷鱼等中克隆到基因，肉味鲜美，营养丰富50%，脂肪对中华绒螯蟹的生长和性腺发育具有重要的作用，其中EPA和DHA等PUFA是中华绒螯蟹等蟹类所必需的脂肪酸，因此探索中华绒螯蟹PUFA合保守区序列引FAD6-F1(+)和FAD6-R1(-)，RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将所述核心片段克隆到载体上并测序， FAD6-F1(+)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，FAD6-R1(-)的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示； (2)根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’和3’ RACE引物FAD6-5’(-)和FAD6-3’(+)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将获