9外源基因的表达解析.ppt

9 外源基因的表达 9.1 概述 9.2 原核表达系统 9.3 真核细胞表达系统 9.4 噬菌体展示技术 9.5 体外表达技术 9.1 概述 已知目标蛋白基因序列，如何表达这个蛋白质？ 从生物体中筛选并鉴定未知蛋白如何进行？ 如何人工创造新的功能蛋白？ 表达异源蛋白质的目的 某些预测蛋白质的鉴定。 生物组织中表达痕量或无法纯化蛋白的实验室制备及功能和结构研究。 具有药用价值的多肽大规模表达纯化（工厂化生产）。 定向突变研究蛋白质结构和功能的关系。 新蛋白的生产及结构和功能的研究。 策略：表达异源蛋白质 选择目标蛋白 各种表达系统————————寄主的不同 原核表达系统 真核表达系统 病毒表达系统 体外表达系统 寄主对异源蛋白表达的影响 外源基因的稳定性 启动子和RNA聚合酶的结合活性 密码子的偏好 mRNA的稳定性 蛋白酶的降解作用 二硫键形成 表达蛋白质的存在形式 为什么要构建表达载体？ 表达载体的基本结构 载体导入寄主方式及存在状态 转化：微生物 转染：细胞 蛋白表达的可控性 检测和纯化方法 PAGE Werstern blot Immunoprecipitation Chromatography 免疫共沉淀法（Immunoprecipitation） 亲和层析Affinity Chromatography 9.2 原核表达系统——E.coli E.coli生长迅速，易高密度培养。 外源基因导入方法简单，并能稳定存在。 遗传背景清晰，异源蛋白表达易控制。 高丰度表达异源蛋白质。 启动子的选择 pLac:乳糖操纵子 λ噬菌体转录启动子PL、PR? T7启动子 pBAD:阿拉伯糖操纵子 Trp启动子 pET expression system 多克隆位点 Fusion tags——用于纯化、鉴定、分泌 E.coli的生长和诱导 E.coli BL21及衍生菌株 DE3 溶原化 缺失 lon 和 ompT 蛋白酶 recA- ，有利于质粒稳定 trxB/gor 突变，能形成正确折叠的含有二硫键的蛋白 稀有密码子的改良 定向突变稀有密码子为最佳密码子。 在E.coli细胞内加入使用稀有密码子的tRNA。 Inclusion body formation Prevention of inclusion body formation 低温（30度）诱导表达蛋白质，使蛋白质更有效折叠。 低丰度表达蛋白质，防止蛋白质聚集。 融合pelB/ompT leader，将蛋白定位于间质（periplasm）。 融合thioredoxin或GST，促进二硫键形成和蛋白质折叠。 真核表达。 9.3 真核细胞表达系统 酵母表达系统 生长迅速，易高密度培养。 高丰度表达异源蛋白质。 遗传背景清晰，异源蛋白表达易控制。 蛋白加工、折叠和翻译后修饰。 毕赤酵母表达载体—整合型 外源基因与染色体的整合 Yeast two-hybrid analysis Reverse two-hybrid analysis Phage Display and mRNA Display 9.5 体外表达技术 无细胞蛋白合成技术； 可以不需要构建表达载体； 快速表达； 适合高通量分析的技术。 Ribosome Display Protein array Huang J , Schreiber S L PNAS 1997;94:13396-13401 Target deconvolution strategies in drug discovery Georg C. Terstappen,et al. Nature Reviews Drug Discovery 6, 891-903 (November 2007) 三种体外表达系统： 兔网织红细胞 麦胚提取物 大肠杆菌提取物 * * 在之前熟悉各项基因工程手段的基础上，如何能够实现一下的目标： 确定寄主 构建表达载体 外源基因导入寄主 诱导表达 检测目标蛋白 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 蓝藻 酵母 哺乳动物细胞 昆虫细胞 高等植物 噬菌体 兔网织红细胞 麦胚提取物 大肠杆菌提取物 目的基因 表达载体 寄主 克隆载体 载体是一种保存和传递工具 天然蛋白 融合蛋白 细菌 酵母 以质粒形式稳定存在 位于染色体之外 整合进染色体内 瞬时表达 稳定表达 Lac I：乳糖操纵子调控基因。 在寄主没有达到一定数量之前，异源蛋白质的表达对细胞有毒性或者抑制细胞生长怎么办？ 带His标签重组蛋白的纯化 原理 分泌蛋白难度大。 缺少某些翻译后修饰：糖基化等。 表达真核生物多肽不易折叠成有功能的蛋白质。 Co-transformation of the