口腔-实验1-分光光度和蛋白测定-凝胶层析法分离血红蛋白和鱼精蛋白离子交换层析法分离混合氨基酸.ppt

掌握分光光度法原理 掌握双缩脲法、BCA法和考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量的原理和操作 熟悉标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用 1760年，Lambert从实验中找到了吸光度A与液层厚度L的关系式： A k1L k1为与被测物性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度和温度有关的常数 双缩脲（Biuret）法测定蛋白质含量 BCA法测定蛋白质含量 考马斯亮蓝法（Bradford 测定蛋白质含量 【原理】 BCA bicinchoninic acid 即二喹啉甲酸，是目前比较理想的蛋白质定量方法。在碱性条件下，蛋白的肽键结构将Cu2+还原为Cu1+ , Cu1+与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。 2.配置BCA工作液：依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配置适量BCA工作液，并充分混匀。 注：配置BCA工作液前请将试剂A摇晃混匀。 3. 标准品及样品的测定 （1）分别取25ul上表中新鲜配置的BSA标准液和待测样品，加入到微孔板中。 （2）每孔中加入200ul BCA工作液，并充分混匀。 （3）加盖，37℃孵育30min后冷却至室温或室温放置2h。 （4）以I号管调零点，于562nm处测定各管吸光度。 （5）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。 BCA试剂A: 1%BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠，0.95%碳酸氢钠，混合调PH值至11.25。 BCA试剂B: 4%硫酸铜 牛血清白蛋白溶液：取0.2g牛血清白蛋白溶于100ml 0.9% NaCl溶液，使其蛋白含量为2mg/ml。 PBS缓冲液 pH7.2-7.4 : NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO4 1.76mmol/L 。 微量加样器 Eppendorf管、试管 恒温水浴锅 微孔板 分光光度计 考马斯亮蓝 Coomassie brilliant blue G-250 G-250在酸性条件下和蛋白质 主要结合碱性或芳香族氨基酸）结合，使得燃料最大吸收峰从465nm变为595nm, 在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。 优点：操作简单、速度快，灵敏度高，与一些还原剂（如DTT、巯基乙醇）兼容 缺点：有些去垢剂、黄酮、碱性缓冲液会干扰测定。 3. 标准品及样品的测定 （1）将25μL样品加入到试管中，并用PBS补足到150ul。 （2）向各试管中加入2.85mL 考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5到10min。 （3）以0号管调零点，于595nm处测定各管吸光度。 （4）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。 考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 牛血清白蛋白溶液：取0.2g牛血清白蛋白溶于100ml 0.9% NaCl溶液，使其蛋白含量为2mg/ml。 PBS缓冲液 pH7.2-7.4 : NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 10mmol/L, KH2PO4 1.76mmol/L 。 1. 微量加样器 2. Eppendorf管、试管 3. 恒温水浴锅 4. 分光光度计 BCA法测定蛋白质含量 优点：灵敏，操作简单，受去污剂影响小，形成络合物稳定。 缺点：相对昂贵 1.5mL离心管 ddH2O μL 2mg/mL BSA μL 蛋白质终浓度 μg/mL A 0 300μL 标准品 2000 B 125 375μL 标准品 1500 C 325 325μL 标准品 1000 D 175 175μL B管混合液 750 E 325 325μL C管混合液 500 F 325 325 μL E管混合液 250 G 325 325μL F管混合液 125 H 400 100 μL G管混合液 25 I 400 0 0 Blank 1.标准品的稀释： 将9支干燥离心管编号,按表加入下列试剂： 【操作步骤】 【试剂】 【器材】 考马斯亮蓝法（Bradford 测定蛋白质含量 【原理】 考马斯亮蓝染液在使用前应平衡温度至室温并温和颠倒混匀。 标准品的稀释： 将8支干燥的试管编号，按表加入下列试剂： Reagent Blank/0 1 2 3 4 5 6 7 2mg/mL BSA μL 0 5 10 15 20 25 3