中药制剂检测技术第五章中药制剂的卫生学检查素材.pptVIP

三、测定方法 供试品 限值确定 最大有效稀释倍数（MVD）确定 供试品干扰实验 正式实验 结果判断 实验流程 供试品内毒素检查：凝胶限度试验 编号 内毒素浓度／被加入内毒素的溶液 平行管数 A 无／供试品溶液 2 B 2λ／供试品溶液 2 C 2λ／检查用水 2 D 无／检查用水 2 A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml)。 1．溶液制备 （1）供试品溶液制备：用细菌内毒素检查用水将供试品配成对应的MVD的浓度A。 （2）供试品阳性对照液的制备： 用被测供试品溶液A将细菌内毒素工作标准品制成2λ浓度的内毒素溶液B。 （3）阳性对照液的制备：用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成2λ浓度的内毒素溶液C。 （4）阴性对照液：细菌内毒素检查用水D MVD的确定和2λ浓度的细菌内毒素溶液的制备。 最大有效稀释倍数（MVD）是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。 MVD=cL/λ 式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg 或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L； λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml） 难点释疑 例：某葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml，则最大稀释倍数MVD=cL/λ=0.5/0.125=4，即可将样品稀释4倍，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。 难点释疑 0.5EU/ml 1.0ml为10000EU/ml 1000EU/ml 0.2ml 1.8ml 100EU/ml 0.2ml 1.8ml 10EU/ml 0.2ml 1.8ml 1EU/ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.25EU/ml 0.2ml 1.8ml 则在本例中2λ浓度的细菌内毒素溶液为0.25EU/ml，若细菌内毒素工作标准品的规格为10000EU/ml，其制备过程可以为下图： 难点释疑 2. 加样反应 取装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管8支， 2支加入0.1ml供试品溶液作为供试品管 2支加入0.1ml 供试品阳性对照液作为供试品阳性对照管。 2支加入0.1ml 阳性对照液作为阳性对照管 2支加入0.1ml阴性对照液作为阴性对照管。 将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃的恒温器中，保温60±2分钟后，将试管取出，缓缓倒转180°，若管内凝胶不变形，不从管壁脱落为阳性(+)，凝胶不能保持完整并从管壁脱落为阴性(-)。 3. 结果判断 观察结果时，若2支供试品阳性对照管和2支阳性对照管均为（+），2支阴性对照管均为(?)，试验有效，否则试验无效 ； 若2支供试品管均为(?)，判定供试品符合规定； 若均为（+），判定供试品不符合规定； 若2支供试品管中1支为(+)，1支为(?)，则另取4支复试，4支中有1支为(+)即认为不合格。 四、注意事项 1．防止鲎试验用水被污染； 2．开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安瓿瓶上的粉末尽可能弹落下去。用砂轮划过安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾异丙醇的无纺布，以避免产生假阳性结果）擦拭，防止开启时玻璃屑落入安瓿内。开启内毒素标准品时，要在安瓿曲颈上部，并尽可能保留较长的安瓿颈，准确加入1.0ml鲎试验用水复溶。 3．细菌内毒素要充分混合均匀，内毒素工作标准品溶解后要在漩涡混合器混合15分钟，以后的每一步稀释前至少混合30秒钟。 4．保温和拿取试管过程中应避免受到振动造成假阴性结果。 5．对灵敏度标示值的误解：如λ=0.06EU/ml,实际上表示的灵敏度λ=0.0625EU/ml，这样写是为了简便，稀释过程中务必要按照λ=0.0625EU/ml来稀释，否则，会影响实验结果。 卫生部教材办公室 人民卫生电子音像出版社 结果判断 验证试验 划线接种：取胆盐乳糖培养基的培养物接种至曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基，观察 革兰氏染色镜检：革兰阴性无芽胞杆菌 适宜的鉴定试验：发酵乳糖产酸； IMViC实验反应为++??或?+??。 管1：1∶10供试液1ml 管2：1∶100供试液1ml 管3：1∶1000供试液1ml 管4：稀释剂1ml 4个装有10ml乳糖胆盐发酵培养基管1、2、3、4 + 18～24h 无菌生长，或有菌生长但不产酸产气 18～24