实验八：NADH正、负向反应测定酶的活性-副本汇总.pptVIP

实验五 NADH正、负向反应测定酶的活性 一、NADH正向反应法测定血清LD(连续监测法) 目的： 1．通过对LD的测定，要求掌握NADH正向反应法测定的基本原理，以及该法测定应注意的事项； 2．熟悉LD测定原理和注意事项及方法学评价；了解利用NADH正向反应法测定其它项目的基本原理。 原理 LD催化下述反应： L一乳酸+NAD+ LD 丙酮酸+NADH+H+ 在反应过程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同时使NAD+还原为NADH。NADH在340nm处有吸收峰，因此反应会引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率与样本中LD的酶活性成正比。 试剂 1 Tris一乳酸锂缓冲液(含Tris 100mmol/L，乳酸锂55mmol／L) : 2．底物应用液(含Tris 100mmol／L，NAD8.5mmol／L) 操作步骤 1．标本要求：血清或肝素抗凝血浆 2．主要参数： 孵育时间：120s 连续检测时间：120s 温度：37℃ 5min S:4μl R1:200μl R2:50μl 340/405nm 结果计算 式中 △A／min：平均每分钟吸光度增加值 6220：340nm处NADH的摩尔吸光系数 V(1.05)：比色液总体积(m1) v(0.05)： 血清用量(m1) L:1cm比色光径。 参考范围:成人109～245 U／L。 注意事项 1·LD活性测定也可用抗凝血浆，但不同抗凝剂对LD测定的影响不同：草酸盐抗凝剂、EDTA能抑制LD活性，而肝素的影响不大。 2·不同的LD同工酶对温度的敏感性是不同的，组织提取液若放于一20℃过夜，，LD4和LD5会丧失全部的活性。血清标本应存放于室温下，一般2～3天不会出现活性的丢失。如果血清标本需要存放较长时间，应加入10mg／ml的NAD+或3．1㎎/ml的谷胱甘肽后于4℃保存。 3·LD活性能被巯基试剂所抑制，另外硼酸、丙二酸、草酸以及EDTA都是竞争性抑制剂。 4·由于红细胞、血小板中含有大量的LD，故严禁使用溶血标本。在采用血浆作为标本时必须用3000r／min离心15min以除去血小板。 方法学评价 乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LD)是糖酵解和糖异生中的一个重要酶，含有锌离子，广泛分布于人和动物组织、植物和微生物中，能可逆地催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之间的氧化还原反应。 其中L~P为正向反应，P~L为逆向反应。正反两向 反应的最适pH不同，其中正向反应最适pH为8.8～9.8，偏碱，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。其优点是乳酸和NAD+稳定性好，且NAD+纯品易得、价格较低，过量乳酸对LD活性的抑制较小，反应线性较好。 缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。 LD活性测定时正向反应和逆向反应都可以运用，但1996年中华医学会检验学会酶学组专家推荐选择正向反应 方法学评价 本实验是根据正向反应(L—P)建立的连续监测法，其优点在于： 乳酸盐与NAD+底物溶液的稳定性较好，冰冻放置可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的影响最小，NAD+较少被产物抑制。 反应的线性范围较宽(726U/L)，重复性较好，精密度较高(LD为65U/L时日间CV％为5.8％，LD为149U/L时日间CV为3.2％) 特异性高(血清中存在的非LD的其他NAD+类氧化还原酶的内源性底物少，加上样本被高度稀释，故这些酶的干扰作用可忽略不计)。 思考题 1．NADH正向反应法测定的基本原理是什么?请列举出应用NADH正向反应法测定其他生化检验项目的原理? 2．LD的测定为什么推荐采用L → P正向反应法?该反应存在哪些缺点? 3．LD的测定的血清标本，在处理和保存中应注意哪些事项? 二、NADH负向反应法测定血清ALT(连续监测法) 目的: 通过对ALT测定，要求掌握NADH负向反应法测定的基本原理，以及该法测定应注意的事项； 掌握单、双试剂测定ALT的原理和方法；熟悉ALT连续监测法测定的优缺点和方法学评价； 了解利用NADH负向反应法测定其他项目的基本原理。 原理 L-丙氨酸+α-酮戊二酸 ALT α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸+NADH LDH 乳酸+NAD+ 连续监测法测定NADH被氧化为NAD+可在340nm连续监测到NADH的消耗量，从而计算出ALT活性浓度ALT双试剂法测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二酸的、底物溶液混合，37℃保温5min，将样品中所含